【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 紀(jì) 80年代后期發(fā)展的基因定點(diǎn)插入 (gene targeting)技術(shù) ， 通過(guò)在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中發(fā)生的外源基因與核基因組目標(biāo)基因之間的 DNA同源重組(homologous bination)， 使外源基因定點(diǎn)地整合到核基因組的特定位置上 ， 從而達(dá)到改變細(xì)胞遺傳特性的目的 。 基因定點(diǎn)插入的分子基礎(chǔ)是在外源定點(diǎn)插入基因與內(nèi)源核基因組目標(biāo)基因之間，必須存在一段適當(dāng)長(zhǎng)度的同源的 DNA序列 。 基因定點(diǎn)插入的基本過(guò)程包括如下幾個(gè)步驟： ① 首先是將外源基因 ， 以及兩側(cè)與內(nèi)源目標(biāo)基因同源的 DNA片段 ， 克隆在具有選擇性標(biāo)記基因(例如 neo)的載體分子上 ， 構(gòu)成專(zhuān)用的基因定點(diǎn)插入載體 (gene targeting vector)； ② 選用適當(dāng)?shù)南拗菩詢(xún)?nèi)切酶切割載體 ， 使之線性化；然后轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞 。 由于用于定點(diǎn)插入的外源基因的兩側(cè) ， 與內(nèi)源核基因組上的目標(biāo)基因或座位之間存在著同源的 DNA序列 ， 因此當(dāng)線性化的載體 DNA被導(dǎo)入受體細(xì)胞之后 ， 兩者便會(huì)彼此配對(duì) 。 ③ 在重組酶 RecBCD的作用下 ， 兩條同源DNA的相同部位便會(huì)發(fā)生同源重組 ， 實(shí)現(xiàn)外源基因在核基因組 DNA上的定點(diǎn)整合 。 現(xiàn)已知道有多方面的因素 ， 諸如受體細(xì)胞的生理狀態(tài)以及外源 DNA的轉(zhuǎn)染方式等 ，都會(huì)影響到基因定點(diǎn)插入的效率 。 鑒于哺乳動(dòng)物基因定點(diǎn)整合效率低下的緣故 ， 因此掌握并利用這些影響因素 ， 對(duì)于提高基因定點(diǎn)插入效率無(wú)疑是十分有益的 。 基因定向插入的效率取決于 DNA同源重組的頻率 ，它是與兩條重組 DNA分子之間的同源序列的長(zhǎng)度密切相關(guān)的 。 應(yīng)用正負(fù)選擇法，已經(jīng)測(cè)定出基因定向插入所需的 DNA同源性的有效長(zhǎng)度。 長(zhǎng)度為 25bp的同源序列即可發(fā)生同源重組。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，當(dāng) DNA同源性的有效長(zhǎng)度介于 259—1800bp之間時(shí)，同源序列越長(zhǎng)，基因定向插入的效率也就越高，兩者成正比； DNA同源性有效長(zhǎng)度在 2kb以上時(shí)，基因定向插入的效率進(jìn)一步提高，同源程度為 14kb時(shí)，達(dá)到最高值；實(shí)驗(yàn)還觀察到，當(dāng) DNA同源序列長(zhǎng)度不到200bp時(shí)，基因定向插入的效率則會(huì)明顯地下降。 (2)基因定向插入的類(lèi)型與應(yīng)用 根據(jù)同源重組過(guò)程中外源定向插入基因在核基因組上整合的結(jié)果，可將基因定向插入?yún)^(qū)分為插入型和置換型兩種不同的形式。 基因定向插入技術(shù)自 20世紀(jì) 80年代誕生以來(lái) ， 經(jīng)過(guò)近 20年的發(fā)展 ， 迄今已成為基因功能研究的一種強(qiáng)有力的手段 。 它無(wú)論在理論探索還是在實(shí)際應(yīng)用上 ， 都具有重要的價(jià)值和廣泛的發(fā)展前景 。 其主要的應(yīng)用有如下幾個(gè)方面： 第一 ， 應(yīng)用基因定向插入技術(shù) ， 能夠?qū)⒔?jīng)體外修飾改造的突變基因或某種新的外源基因 ， 取代受體細(xì)胞核基因組上的目標(biāo)基因 ， 使基因組獲得新的遺傳信息 ， 以便使科學(xué)工作者能夠相當(dāng)有效地檢測(cè)基因的功能 。 第二 ， 應(yīng)用基因定向插入技術(shù) ， 也可以在核基因組的目標(biāo)基因序列附近 ，插入一個(gè)具相同調(diào)控序列的同源基因拷貝 。 如此既可形成重復(fù)基因 ， 提高表達(dá)效率和相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量 ， 又可能不會(huì)破壞目標(biāo)基因及其鄰近基因的功能 。 第三 ， 利用基因定向插入技術(shù) ， 還可以在核基因組內(nèi)部增加一段 DNA序列 ，或造成序列缺失 ， 甚至是單堿基定點(diǎn)突變等 ， 從而達(dá)到抑制或糾正目標(biāo)基因的功能 ， 為遺傳疾病的基因治療提供技術(shù)途徑 。 (3)正負(fù)選擇法 轉(zhuǎn)染 DNA與內(nèi)源基因組 DNA之間的同源重組事件 ， 是由轉(zhuǎn)染 DNA的自由末端激發(fā)的 。一般認(rèn)為 ， 在酵母細(xì)胞中發(fā)生同源重組的頻率比較高 ， 也容易檢測(cè) 。 而哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染 DNA發(fā)生隨機(jī)整合的機(jī)率相當(dāng)高 ，而同源重組的頻率則相當(dāng)?shù)?。 正是由于這種緣故 ， 給哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因定向插入事件的檢測(cè)造成了很大的困難 。 為了克服這種困難，已經(jīng)發(fā)展出了一種用于富集同源重組事件的特殊的試驗(yàn)體系，它涉及到正選擇和負(fù)選擇兩個(gè)重要內(nèi)容，所以特稱(chēng)為 正負(fù)選擇（ positivenegative selection）法。 基因定向插入載體上有兩個(gè)選擇標(biāo)記基因： neo基因叫做正選擇標(biāo)記基因 ， 可抑制抗菌素 G418的活性 。 因此 ， 獲得的 neo基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞 ， 呈 G418抗性 ， 能夠在含有 G418抗菌素的選擇培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 、 存活 。 HSVtk基因叫做負(fù)選擇標(biāo)記基因 ， 它編碼的單純皰疹病毒胸苷激酶 ， 可以把核苷類(lèi)似物 ， 例如 9(1,3二羥 2丙氧甲基 )鳥(niǎo)嘌呤 (GCV)， 轉(zhuǎn)變成為毒性的核苷酸 ， 造成細(xì)胞中毒死亡 。 因此 ， 選擇培養(yǎng)基中的 GCV能夠特異性地殺死表達(dá)HSVtk基因的轉(zhuǎn)化細(xì)胞 。 (5) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn) 胚胎干細(xì)胞 (embryonic stem cell) 簡(jiǎn)稱(chēng) ES細(xì)胞 ，系指哺乳動(dòng)物囊胚期胚胎 (即胚泡 )的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中的一種未分化的細(xì)胞 。 它具有如同癌細(xì)胞那樣的無(wú)限繁殖和多潛能 (Multipotential)的發(fā)育能力 ，并且可在體外培養(yǎng)條件下長(zhǎng)期保持未分化的狀態(tài) 。當(dāng)將經(jīng)過(guò)體外遺傳操作 (例如導(dǎo)入了打靶基因 )的ES細(xì)胞重新轉(zhuǎn)移到胚泡之內(nèi) ， 并移植在養(yǎng)母子宮中生長(zhǎng) ， 便可發(fā)育成嵌合動(dòng)物 。 由于 ES細(xì)胞具有諸多方面的優(yōu)越性，故特別適合于用作基因敲除實(shí)驗(yàn) (gene knockout experiment)。不過(guò) ES細(xì)胞株的建立，卻是一件十分困難的事情，迄今為止還只有為數(shù)不多的 ES細(xì)胞株系可供有關(guān)研究工作使用。 在這里我們選用小鼠 ES細(xì)胞為例，闡述哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因敲除實(shí)驗(yàn)的基本過(guò)程 ： 第一步： 根據(jù)受體細(xì)胞核基因組中待敲除的目標(biāo)基因之核苷酸序列的結(jié)構(gòu)特征 ，在 體外構(gòu)成一種具有失活基因或糾正基因的 DNA片段 。 然后將此片段克隆在一種具有選擇標(biāo)記基因的置換型基因定向插入載體上 。 第二步： 將此載體經(jīng)適當(dāng)限制酶消化作用而被線性化之后 ， 轉(zhuǎn)染給培養(yǎng)的小鼠 ES細(xì)胞 。 由于定向插入 DNA片段的兩側(cè)與目標(biāo)基因兩端之間存在同源的 DNA序列 ， 因此它可通過(guò)同源重組置換核基因組中的具功能活性的目標(biāo)基因 ， 也就是說(shuō)把目標(biāo)基因敲除掉 。 第三步： 應(yīng)用正負(fù)選擇法分離出已成功地敲除掉了目標(biāo)基因的 ES細(xì)胞克隆 ， 這樣的ES細(xì)胞系亦叫做突變的 ES細(xì)胞 。 第四步： 挑選生活力旺盛的突變的 ES細(xì)胞 ，體外注射到超數(shù)排卵的供體小鼠的胚泡中 。這個(gè)過(guò)程叫做胚胎干細(xì)胞轉(zhuǎn)移 (embryonic stem cell transfer)。 第五步： 將此胚泡移植 （ Transplant） 到受體母鼠 ， 亦稱(chēng)養(yǎng)母 (foster mother)的子宮中 。由此發(fā)育長(zhǎng)成的當(dāng)代轉(zhuǎn)基因小鼠 ， 其個(gè)體中含有一定比例的來(lái)自 ES細(xì)胞的細(xì)胞群體 ，稱(chēng)為嵌合鼠 。 實(shí)驗(yàn)中所用的供體小鼠 、 受體小鼠和提供 ES細(xì)胞的小鼠 ， 三者均應(yīng)是屬于近交系 (inbred line)。 三、轉(zhuǎn)化載體 （一） SV40病毒載體 在動(dòng)物基因工程的研究領(lǐng)域中 ， 關(guān)于病毒載體方面的工作 ， 占據(jù)著相當(dāng)重要的地位 。已有許多實(shí)驗(yàn)證明 ， 一些具有 DNA基因組或其生活史中出現(xiàn)有 DNA階段的真核生物的病毒 ， 經(jīng)改建后 ， 都可以發(fā)展成為動(dòng)物基因工程的