【文章內(nèi)容簡介】 紀 80年代后期發(fā)展的基因定點插入 (gene targeting)技術(shù) ， 通過在轉(zhuǎn)染細胞中發(fā)生的外源基因與核基因組目標基因之間的 DNA同源重組(homologous bination)， 使外源基因定點地整合到核基因組的特定位置上 ， 從而達到改變細胞遺傳特性的目的 。 基因定點插入的分子基礎(chǔ)是在外源定點插入基因與內(nèi)源核基因組目標基因之間，必須存在一段適當長度的同源的 DNA序列 。 基因定點插入的基本過程包括如下幾個步驟： ① 首先是將外源基因 ， 以及兩側(cè)與內(nèi)源目標基因同源的 DNA片段 ， 克隆在具有選擇性標記基因(例如 neo)的載體分子上 ， 構(gòu)成專用的基因定點插入載體 (gene targeting vector)； ② 選用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切割載體 ， 使之線性化；然后轉(zhuǎn)化受體細胞 。 由于用于定點插入的外源基因的兩側(cè) ， 與內(nèi)源核基因組上的目標基因或座位之間存在著同源的 DNA序列 ， 因此當線性化的載體 DNA被導入受體細胞之后 ， 兩者便會彼此配對 。 ③ 在重組酶 RecBCD的作用下 ， 兩條同源DNA的相同部位便會發(fā)生同源重組 ， 實現(xiàn)外源基因在核基因組 DNA上的定點整合 。 現(xiàn)已知道有多方面的因素 ， 諸如受體細胞的生理狀態(tài)以及外源 DNA的轉(zhuǎn)染方式等 ，都會影響到基因定點插入的效率 。 鑒于哺乳動物基因定點整合效率低下的緣故 ， 因此掌握并利用這些影響因素 ， 對于提高基因定點插入效率無疑是十分有益的 。 基因定向插入的效率取決于 DNA同源重組的頻率 ，它是與兩條重組 DNA分子之間的同源序列的長度密切相關(guān)的 。 應用正負選擇法，已經(jīng)測定出基因定向插入所需的 DNA同源性的有效長度。 長度為 25bp的同源序列即可發(fā)生同源重組。在哺乳動物細胞中，當 DNA同源性的有效長度介于 259—1800bp之間時，同源序列越長，基因定向插入的效率也就越高，兩者成正比； DNA同源性有效長度在 2kb以上時，基因定向插入的效率進一步提高，同源程度為 14kb時，達到最高值；實驗還觀察到，當 DNA同源序列長度不到200bp時，基因定向插入的效率則會明顯地下降。 (2)基因定向插入的類型與應用 根據(jù)同源重組過程中外源定向插入基因在核基因組上整合的結(jié)果，可將基因定向插入?yún)^(qū)分為插入型和置換型兩種不同的形式。 基因定向插入技術(shù)自 20世紀 80年代誕生以來 ， 經(jīng)過近 20年的發(fā)展 ， 迄今已成為基因功能研究的一種強有力的手段 。 它無論在理論探索還是在實際應用上 ， 都具有重要的價值和廣泛的發(fā)展前景 。 其主要的應用有如下幾個方面： 第一 ， 應用基因定向插入技術(shù) ， 能夠?qū)⒔?jīng)體外修飾改造的突變基因或某種新的外源基因 ， 取代受體細胞核基因組上的目標基因 ， 使基因組獲得新的遺傳信息 ， 以便使科學工作者能夠相當有效地檢測基因的功能 。 第二 ， 應用基因定向插入技術(shù) ， 也可以在核基因組的目標基因序列附近 ，插入一個具相同調(diào)控序列的同源基因拷貝 。 如此既可形成重復基因 ， 提高表達效率和相關(guān)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量 ， 又可能不會破壞目標基因及其鄰近基因的功能 。 第三 ， 利用基因定向插入技術(shù) ， 還可以在核基因組內(nèi)部增加一段 DNA序列 ，或造成序列缺失 ， 甚至是單堿基定點突變等 ， 從而達到抑制或糾正目標基因的功能 ， 為遺傳疾病的基因治療提供技術(shù)途徑 。 (3)正負選擇法 轉(zhuǎn)染 DNA與內(nèi)源基因組 DNA之間的同源重組事件 ， 是由轉(zhuǎn)染 DNA的自由末端激發(fā)的 。一般認為 ， 在酵母細胞中發(fā)生同源重組的頻率比較高 ， 也容易檢測 。 而哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染 DNA發(fā)生隨機整合的機率相當高 ，而同源重組的頻率則相當?shù)?。 正是由于這種緣故 ， 給哺乳動物細胞的基因定向插入事件的檢測造成了很大的困難 。 為了克服這種困難，已經(jīng)發(fā)展出了一種用于富集同源重組事件的特殊的試驗體系，它涉及到正選擇和負選擇兩個重要內(nèi)容，所以特稱為 正負選擇（ positivenegative selection）法。 基因定向插入載體上有兩個選擇標記基因： neo基因叫做正選擇標記基因 ， 可抑制抗菌素 G418的活性 。 因此 ， 獲得的 neo基因的轉(zhuǎn)化細胞 ， 呈 G418抗性 ， 能夠在含有 G418抗菌素的選擇培養(yǎng)基中生長 、 存活 。 HSVtk基因叫做負選擇標記基因 ， 它編碼的單純皰疹病毒胸苷激酶 ， 可以把核苷類似物 ， 例如 9(1,3二羥 2丙氧甲基 )鳥嘌呤 (GCV)， 轉(zhuǎn)變成為毒性的核苷酸 ， 造成細胞中毒死亡 。 因此 ， 選擇培養(yǎng)基中的 GCV能夠特異性地殺死表達HSVtk基因的轉(zhuǎn)化細胞 。 (5) 哺乳動物細胞基因敲除實驗 胚胎干細胞 (embryonic stem cell) 簡稱 ES細胞 ，系指哺乳動物囊胚期胚胎 (即胚泡 )的內(nèi)細胞團中的一種未分化的細胞 。 它具有如同癌細胞那樣的無限繁殖和多潛能 (Multipotential)的發(fā)育能力 ，并且可在體外培養(yǎng)條件下長期保持未分化的狀態(tài) 。當將經(jīng)過體外遺傳操作 (例如導入了打靶基因 )的ES細胞重新轉(zhuǎn)移到胚泡之內(nèi) ， 并移植在養(yǎng)母子宮中生長 ， 便可發(fā)育成嵌合動物 。 由于 ES細胞具有諸多方面的優(yōu)越性，故特別適合于用作基因敲除實驗 (gene knockout experiment)。不過 ES細胞株的建立，卻是一件十分困難的事情，迄今為止還只有為數(shù)不多的 ES細胞株系可供有關(guān)研究工作使用。 在這里我們選用小鼠 ES細胞為例，闡述哺乳動物細胞基因敲除實驗的基本過程 ： 第一步： 根據(jù)受體細胞核基因組中待敲除的目標基因之核苷酸序列的結(jié)構(gòu)特征 ，在 體外構(gòu)成一種具有失活基因或糾正基因的 DNA片段 。 然后將此片段克隆在一種具有選擇標記基因的置換型基因定向插入載體上 。 第二步： 將此載體經(jīng)適當限制酶消化作用而被線性化之后 ， 轉(zhuǎn)染給培養(yǎng)的小鼠 ES細胞 。 由于定向插入 DNA片段的兩側(cè)與目標基因兩端之間存在同源的 DNA序列 ， 因此它可通過同源重組置換核基因組中的具功能活性的目標基因 ， 也就是說把目標基因敲除掉 。 第三步： 應用正負選擇法分離出已成功地敲除掉了目標基因的 ES細胞克隆 ， 這樣的ES細胞系亦叫做突變的 ES細胞 。 第四步： 挑選生活力旺盛的突變的 ES細胞 ，體外注射到超數(shù)排卵的供體小鼠的胚泡中 。這個過程叫做胚胎干細胞轉(zhuǎn)移 (embryonic stem cell transfer)。 第五步： 將此胚泡移植 （ Transplant） 到受體母鼠 ， 亦稱養(yǎng)母 (foster mother)的子宮中 。由此發(fā)育長成的當代轉(zhuǎn)基因小鼠 ， 其個體中含有一定比例的來自 ES細胞的細胞群體 ，稱為嵌合鼠 。 實驗中所用的供體小鼠 、 受體小鼠和提供 ES細胞的小鼠 ， 三者均應是屬于近交系 (inbred line)。 三、轉(zhuǎn)化載體 （一） SV40病毒載體 在動物基因工程的研究領(lǐng)域中 ， 關(guān)于病毒載體方面的工作 ， 占據(jù)著相當重要的地位 。已有許多實驗證明 ， 一些具有 DNA基因組或其生活史中出現(xiàn)有 DNA階段的真核生物的病毒 ， 經(jīng)改建后 ， 都可以發(fā)展成為動物基因工程的