基因工程dna誘變ppt課件(已修改)
2025-09-23 18:24 本頁面
【正文】 第十章 DNA誘變突變是研究基因結(jié)構(gòu)與功能的最基本手段。經(jīng)典方法： 分離自發(fā)突變體或用物理、化學(xué)誘變劑處理活體來獲得突變，再根據(jù)突變體的表型，采用遺傳學(xué)方法鑒定相應(yīng)基因。體外誘變： 對克隆化的 DNA進(jìn)行誘變處理，改變其核苷酸序列，從而獲得突變基因，用于基因工程、蛋白質(zhì)工程等研究。定向進(jìn)化的原理第一節(jié) 隨機誘變體外隨機誘變： 指隨機地在克隆化 DNA中引入堿基置換突變。特點： 不需要有序列針對性的合理設(shè)計，引入突變的位置隨機；結(jié)果： 在目的 DNA片段中引入大量的序列多樣性；方法： 錯誤摻入誘變、增變菌株誘變、盒式誘變、化學(xué)誘變；用途： 誘變基因的編碼區(qū)，改變氨基酸序列，從而改造蛋白質(zhì)的性質(zhì)或活性，得到符合需要的蛋白質(zhì)。定向進(jìn)化： 對于某些實驗?zāi)康?，一次突變很難獲得滿意的結(jié)果，通常采用反復(fù)多次誘變和循環(huán)，其目的是獲得滿足人們需要的性能改良的蛋白質(zhì)，又稱為 試管進(jìn)化 。一、錯誤摻入突變概念： 在體外 DNA擴增中，使用具有錯配傾向的 DNA聚合酶以及反應(yīng)條件，使堿基錯誤摻入到新合成的基因中，又稱易錯PCR（ errorpronePCR）。errorpronePCR的實質(zhì)： 通過改變 PCR反應(yīng)條件來調(diào)整 PCR反應(yīng)中突變的頻率，降低聚合酶固有的突變序列傾向性，提高突變譜的多樣性，使得錯誤堿基隨機地以一定的頻率摻入到擴增的基因中，從而得到隨機突變的 DNA群體，最后用合適的載體克隆突變基因。易錯 PCR采用的方法：?增加 MgCl2濃度到 7mM，穩(wěn)定非互補的堿基配對；?加入 MnCl2， Mn2+能降低聚合酶對模板的特異性；?增加聚合酶量到 5U，促使在錯配堿基處繼續(xù)延伸反應(yīng)；?限定 4種堿基中的一種，通常為正常濃度的 110% ，在缺乏正確核苷酸時， DNA聚合酶經(jīng)短暫停頓后，會插入另外 3種可用核苷酸的一種；?3種為正常濃度的正常堿基，第四種為次黃嘌呤 dITP（可與 C、 T、 A配對）；?增加 dCTP和 dTTP的濃度到 1mM，促進(jìn)錯誤摻入；?使用突變 DNA聚合酶，如 Mutazyme。二、盒式誘變盒式取代誘變 混合寡核苷酸誘變盒式取代誘變種類簡單的 盒式取代誘變 是通過限制性酶切除去特定的雙鏈 DNA片段，再與含有突變的單一序列雙鏈寡核苷酸連接 ,得到取代突變，是一種定點誘變?；旌瞎押塑账嵴T變混合寡核苷酸誘變： 若用于取代的是含有隨機突變的混合雙鏈寡核苷酸，則可在限定區(qū)域內(nèi)引入大量的隨機突變。三、增變菌株的誘變作用
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