【正文】 R操作方式可較好解決這一問題。在遇到這個問題時，如果將反應(yīng)成分分開配制， A 管含模板、引物和 dNTP ，以及調(diào)整體積的 H2O ， B 管含緩沖液、 DNA 聚合酶和水，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題。539。早期的 PCR 儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應(yīng)液上覆蓋一層礦物油，防止水分蒸發(fā)。 92 5． PCR 反應(yīng)液的配制 PCR反應(yīng)體系的配置方式有時也會影響反應(yīng)的正常進行。 ?平臺效應(yīng)（ plateau effect）： PCR 擴增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定，一般采用 1kb 用 1 分鐘來保證充足的時間。 90 3．反應(yīng)時間 變性步驟一般使用 30 秒鐘，如果模板的 G+C 含量較高，或直接用細胞做模板，變性時間可適當(dāng)延長。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為 72℃ 。 88 （三） PCR反應(yīng)程序 1．常規(guī)程序 預(yù)變性 : 9496℃ 幾十秒至幾分鐘 變性： 94℃ 、 30 秒鐘 退火： 5065℃ 、 30 秒鐘； 25～ 35 次循環(huán) 延伸： 72℃ 、 1 分鐘 72℃ 保持 37min 4℃ 保存 89 2．復(fù)性（退火）和延伸溫度 復(fù)性的溫度是 PCR 擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在 5060℃ 之間。539。 外切活性，在擴增過程中有 11x10 5 的錯配幾率。由于沒有 339。在 95℃ 的半衰期為 40 分鐘。539。339。339。 86 5． DNA 聚合酶 ① Taq DNA 聚合酶 來自嗜熱古細菌的嗜熱水生菌（ Thermus aquaticus） ， Taq DNA 聚合酶分子量大小為 94kDa ，為單分子酶，在 75℃ 活性最強。用人類或哺乳動物基因組 DNA 進行擴增時，一般使用 1μg DNA , 相當(dāng)于單拷貝基因有 3 105 個拷貝。 85 4． 模板 模板的數(shù)量會直接影響擴增的效果。 84 3． 引物 在多數(shù)試驗中人們習(xí)慣使用的引物濃度為各 1mM ，即 1pmol/ml ， 在 100 μl 反應(yīng)體系中相當(dāng)于 6x1013個分子。 83 2． 脫氧核苷三磷酸（ dNTP） 脫氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，標準的 PCR 反應(yīng)體系中含有等摩爾濃度的 4 種 dNTP ，即 dATP、 dTTP、 dCTP 和 dGTP ，終濃度一般為 200mM（即飽和濃度）。緩沖液中還含有 50mM 的鉀離子。一般以 MgCl2 的形式提供，標準濃度為 。HCl ， pH 為 （室溫），而在延伸溫度（ 72 ℃ ）下，pH 值接近 。這三個熱反應(yīng)過程的重復(fù)稱為一個循環(huán)，經(jīng)過 2040 個循環(huán)可擴增得到大量位于兩條引物之間序列的 DNA 片段。 78 2． PCR 擴增的步驟 首先將模板 DNA 置于 92℃ 96℃ ，進行變性 （ denaturation）處理，使 dsDNA 在高溫下解鏈成為 ssDNA ，且熱變性不改變其化學(xué)性質(zhì)；然后 退火 （ annealing） ，將溫度降至 37℃ 72℃ ，使引物與模板的互補區(qū)相結(jié)合；最后，在 72℃ 條件下， DNA 聚合酶將 dNTP 連續(xù)加到引物的 339。在 PCR 擴增中一般使用合成的寡核苷酸作引物。待拷貝的 DNA 稱為模板，它可以是雙鏈 DNA 也可是單鏈 DNA，最后擴增得到的產(chǎn)物是雙鏈狀態(tài)的。 PCR 技術(shù)還廣泛應(yīng)用于鑒定、診斷等領(lǐng)域。 PCR 技術(shù)應(yīng)用廣泛，可以通過 A/T 克隆、 UDG 克隆等方法介導(dǎo)克隆，還可以通過同源重組、 重疊延伸等方法介導(dǎo)定點誘變。 76 PCR 擴增，主要的是引物設(shè)計，引物設(shè)計需要遵循一定的原則。 目的基因： ? 純度很高 ? 片斷大小適于重組操作 第四節(jié) 獲得真核生物目的基因的方法 74 目的基因的獲得方法 ? 分離 ? 化學(xué)合成 75 一、利用 PCR法獲取目的基因 :polymerase chain reaction,聚合酶鏈式反應(yīng)，是 80年代發(fā)展起來的新技術(shù)，是通過模擬體內(nèi) DNA復(fù)制的方式，在體外選擇性地將 DNA 某個特殊區(qū)域擴增出來的技術(shù)。 這樣的基因通常稱之為 目的基因 。 73 基因工程的主要目的是通過 優(yōu)良性狀相關(guān)基因 的 重組 ， 獲得具有高度應(yīng)用價值的 新物種 。 ?噬菌體載體可以成功的應(yīng)用來作為擴增外源基因拷貝數(shù)的克隆載體，使外源基因得到最大限度的表達。 70 λ噬菌體載體的主要類型 ?插入型載體： 外源 DNA克隆到插入型載體分子上 ， 會使噬菌體的某種生物功能喪失效力 . ? 免疫功能失活 （ inactivation of immunity function) ? 大腸桿菌 ?－半乳糖苷酶失活 （ inactivation of ?galactosidase) ? 替換型載體 載體 DNA分子中有一段可以被替換的 DNA片斷 71 用 λ噬菌體作為克隆載體 72 ?噬菌體 DNA的復(fù)制 （ 1)感染早期，環(huán)形 DNA分子可以按 ?形式從雙向進行復(fù)制；感染晚期， 滾動復(fù)制。 ? 用合適的限制性內(nèi)切酶切去部分非必需區(qū) ， 但是由此構(gòu)建的 λDNA載體不應(yīng)小于 38 kb。 68 ?噬菌體的cos末端 COS 5’CGGGGCGGCGACTCG3’ 3’GCCCCGCCGCTGAGC5’ 5’CG GGGCGGCGACTCG3’ 3’GCCCCGCCGCTGA GC5’ COS 非必須區(qū) 長臂 (左 ) 短臂 (右 ) ?－噬菌體 ?－噬菌體染色體組 蛋白外殼 DNA ?－噬菌體 COS末端 連接（感染后） 裂解（包裝過程） 69 構(gòu)建 λ噬菌體載體的基本途徑為： ?抹去某種限制性內(nèi)切酶在 λDNA分子上的一些識別序列 ， 只在非必需區(qū)保留 12個識別序列 。 ?λDNA分子上有多種限制性內(nèi)切酶的識別序列 ， 便于用這些酶切割產(chǎn)生外源 DNA片段的插入和置換 。 ? λDNA上的 D基因和 E基因?qū)κ删w的包裝起決定性作用 ， 缺任何一種基因都將導(dǎo)致噬菌體不能包裝 。連接處稱之為 cos位點。 61 多克隆位點 質(zhì)粒載體 pUC 19 在 pBR322基礎(chǔ)上構(gòu)建的系列載體 Lac Z’ 半乳糖苷酶基因，在含 Xgal培養(yǎng)基上呈藍色，插入外源 DNA，重組子培養(yǎng)呈白色 MSC 區(qū)段 pUC優(yōu)點： ?具有更小的分子量，更高的拷貝數(shù)； ?適用于用組織化學(xué)方法檢測重組子； ?具有多克隆位點MSC區(qū)段，與M13mp8噬菌體相同的克隆區(qū)段 62 （二）其他質(zhì)粒載體 低拷貝數(shù)載體 檢測轉(zhuǎn)錄控制信號的載體 表達載體：是在常規(guī)克隆載體的基礎(chǔ)上衍生而來的，主要增添了強啟動子，以及有利于表達產(chǎn)物分泌、分離或純化的元件 63 噬菌體 噬菌體內(nèi)含雙鏈環(huán)形 、 單鏈環(huán)形 、 雙鏈線形 、 單鏈線形等多種形式 、 大小不一的 DNA， 最常見的是雙鏈線形 DNA, 且感染率高 。 56 The bacterial chromosome and bacterial plasmids, as shown in the electron microscope. Plasmid DNA Circular structure Plasmid DNA Circular structure Broken cell 57 Broken cell The use of plasmid pBR322 as a cloning vector, showing how insertion of foreign DNA causes inactivation of the tetracycline resistance gene, permitting easy identification of transformants containing the cloned DNA fragment 58 外源基因克隆入質(zhì)粒載體的過程 酶處理防止自身環(huán)化 缺口由宿主細胞的連接酶修復(fù) 59 DNA cloning using bacterial plasmids E. Coli chromosome Plasmid Purify plasmid DNA Purify human DNA Treat with EcoR1 to cleave both human and bacterial DNA into different sized fragments Insulin gene Incubate E. coli cells under conditions where they will take up plasmids from the medium Population of plasmids containing different segments of human DNA Plasmid free E. coli Join fragments into rebinant DNAs with DNA ligase Ribosomal RNA gene 60 （ 2） 質(zhì)粒載體 pUC 18/19 這對載體由 2686bp組成 ， 帶有 pBR 322的復(fù)制起始位點 ， 一個氨芐青霉素抗性基因和一個大腸桿菌乳糖操縱子 ?半乳糖苷酶基因 (lacZ’ )的調(diào)節(jié)片段 ， 一個調(diào)節(jié) lacZ’ 基因表達的阻遏蛋白(repressor)的基因 lac I， 還有多個單克隆位點 。 易于自身 DNA的純化及克隆載體的純化 ② 具有兩種抗菌素抗性基因可作轉(zhuǎn)化子的選擇記號 ③ 具有較高的拷貝數(shù) 。 克隆 載體必須具備的基本條件： ?具有復(fù)制起點 ?具有抗菌素抗性基因 ?具有若干個限制酶單一識別位點 ?具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù) 55 （ 1)質(zhì)粒載體 pBR 322 pBR 322大小為 4361 bp， 由人工改造而來 ， 有一個復(fù)制起點 、 一個抗氨芐青霉素基因 、 一個抗四環(huán)素基因 、多種限制酶切點 （ 36個 ） ， 可容納 5kb左右外源 DNA。 在細胞中合成的這種酶可以分泌至外周質(zhì)腔，保護宿主不受這些抗生素的影響。 53 （ 4 ）卡那霉素和新霉素抗性基因（ kan r, neor） 卡那霉素和新霉素是一種脫氧鏈霉胺氮基糖苷，都可與核糖體結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。 cat 基因編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶，一個四聚體細胞質(zhì)蛋白（每個亞基 23kDa）。 52 （ 3）氯霉素抗性基因（ Cm r, cat） 氯霉素可與核糖體 50S 亞基結(jié)合并抑制蛋白質(zhì)合成。四環(huán)素抗性基因編碼一個由 399 個氨基酸組成的膜結(jié)合蛋白，可阻止四環(huán)素進入細胞。 氨芐青霉素抗性基因編碼一個酶，該酶可分泌進入細菌的周質(zhì)區(qū)，抑制轉(zhuǎn)肽反應(yīng)并催化 β內(nèi)酰胺環(huán)水解，從而解除了氨芐青霉素的毒性。 50 氨芐青霉素抗性基因是基因操作中使用最廣泛的選擇標記，絕大多數(shù)在大腸桿菌中克隆的質(zhì)粒載體帶有該基因。 可分為： 1. 轉(zhuǎn)移 2. 帶動轉(zhuǎn)移 49 選擇標記