【正文】 A分子 更為穩(wěn)定。 ? 優(yōu)點：比抗藥性插入失活平板篩選法更進一步。合成重組 DNA編碼的蛋白質(zhì)，產(chǎn)物經(jīng)SDSPAG電泳，自顯影以及水解后指紋圖譜分析，即可判斷目的基因的表達結(jié)果。還需要加入各種氨基酸、磷酸肌酸激酶、磷酸肌酸、無機離子及還原劑等。如大腸桿菌、小麥胚、玉米胚、果蠅等。 ? （ 3）、無細胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)： ? 無細胞體系是一種具有高水平翻譯能力的體外合成反應(yīng)系統(tǒng)。這種狀態(tài)的細胞稱為大細胞系統(tǒng)。 ? 方法：將重組 DNA轉(zhuǎn)化到能產(chǎn)生小細胞的大腸桿菌中， ? —— 通過選擇與培養(yǎng)即可獲得含重組 DNA小細胞 —— 用速度沉降法離心，分離出小細胞 ——如果表達的產(chǎn)物是蛋白質(zhì)，則在反應(yīng)體系中加入 35Smet 及其它的氨基酸原料，即合成蛋白質(zhì) —— 然后將合成的產(chǎn)物用 SDSPAG電泳分析，并進行自顯影 —— 就可以檢測重組質(zhì)粒表達情況（如產(chǎn)物的種類、大小與相對含量）。目前用于檢查工程細胞目的產(chǎn)物表達情況的轉(zhuǎn)錄 翻譯系統(tǒng)有： ? （ 1）、小細胞轉(zhuǎn)譯系統(tǒng)： ? 原理：某些大腸桿菌在生長過程中能產(chǎn)生含重組質(zhì)粒而不含宿主 DNA的無生命小泡稱為小細胞。因此所獲得的重組體能否表達相應(yīng)產(chǎn)物是關(guān)鍵的問題。 轉(zhuǎn)譯篩選法 ? 概述：在基因工程中。 ? 這種方法的缺點是只能檢測分泌出細胞的蛋白質(zhì)，這就限制了該法的應(yīng)用。 ? 方法：在生長菌落的瓊脂培養(yǎng)基中，加入專門抗這種蛋白質(zhì)分子 的特異性抗體。 （ 2）、免疫沉淀檢測法 ? 這種方法相對于放射性免疫法來講，靈敏度要低，而且易受干擾。而不會被洗脫掉， ? 通過體外碘化作用， IgG抗體便會被放射性同位素 125I 標記上。 ? （ 1）、放射性抗體檢測方法： ? 原理：一種免疫血清含有 IgG抗體，它們識別抗原分子的不同決定簇，并分別與各自的抗原決定簇相結(jié)合。 ? 利用免疫學(xué)方法篩選： ? 免疫學(xué)方法是間接篩選方法，也就是利用特異抗體與目的基因表達產(chǎn)物相互作用進行篩選的方法。 ? 優(yōu)點：可以廣泛的應(yīng)用。 ? 原位雜交技術(shù)：讓含有重組體的菌落或是噬菌斑，由平板轉(zhuǎn)移到膜上并釋放 DNA ，變性并固定在膜上，再同 DNA探針雜交的方法。故也稱為原位雜交技術(shù)或菌落（噬菌斑）雜交。 ? 利用核酸雜交技術(shù)篩選： ? 從基因文庫中篩選帶有目的基因插入序列的克隆，最廣泛應(yīng)用的是核酸分子雜交技術(shù)。 ? 這種篩選要求： ? （ 1）、克隆的 DMA片斷是一個完整的基因序列； ? （ 2）、而且能夠在大腸桿菌中實現(xiàn)功能表達。半乳糖苷酶顯色反應(yīng)選擇法： ? 原理： ? 優(yōu)點：是更為簡單的方法 。但有時由于試劑或操作規(guī)程方面的原因，自身環(huán)化的載體分子有時也會失去特定的遺傳標記。 ? 這些特征一個是克隆載體提供的這是最主要的也是應(yīng)用最多的；另一個是插入的外源 DNA序列提供的，相對來說數(shù)量較少。 ? 間接篩選是不直接測定基因，而是利用其它方法，例如利用特異性抗體與目的基因表達產(chǎn)物相互作用對重組體的篩選。 ? 依據(jù)是根據(jù)載體體系、宿營主細胞的特征以及外源基因在受體細胞表達不同，即： ? 直接篩選方法：是針對載體攜帶的某種標記基因和目的基因而設(shè)計的篩選方法。 ? 以入噬菌體作基因載體進行基因克隆有以下優(yōu)點： ? 具有很大的外源 DNA包容能力，對外源基因的克隆效率高； ? 有非常高的入重組回收率，特別是適用于建立基因庫； ? 具有正性篩選性質(zhì)。 ? 得到包裝提取物的方法 ： ? 一種是雖然可以從入噬菌體直接提取到包裝蛋白，但是這種方法比較復(fù)雜，不能成為常規(guī)技術(shù)。 ? A蛋白：與入噬菌體 DNA插入頭部，與粘性末端形成有關(guān)。 ? 包裝提取物（ packaging extract）包括： ? E蛋白：是噬菌體頭部的主要成分。 ? 所謂體外包裝：就是在體外將重組的 DNA放置到噬菌體的外殼里，然后通過正常的噬菌體感染過程，將它們導(dǎo)入宿主細胞。 ? 限制 性轉(zhuǎn)導(dǎo)：由溫和噬菌體和病毒 DNA為載體構(gòu)成的重組 DNA分子，經(jīng)體外包裝成完整的噬菌體或病毒顆粒的轉(zhuǎn)導(dǎo)作用。 ? 重組體 DNA的體外包裝及入噬菌體的轉(zhuǎn)導(dǎo)： ? 問題：什么是轉(zhuǎn)導(dǎo)？什么是體外包裝？體外包裝的基本原理和方法怎樣？ ? 轉(zhuǎn)導(dǎo)：以病毒為介導(dǎo)（載體）將遺傳物質(zhì)從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞的過程。 ? 轉(zhuǎn)化頻率：指在受體細胞過量的情況下，重組 DNA所能獲得的轉(zhuǎn)化子的菌落數(shù)。而過程相同的， 也就是說本質(zhì)上兩者之沒有根本的差別， ? 所以習(xí)慣上人們往往也把轉(zhuǎn)染通稱為廣義的轉(zhuǎn)化。 ? 轉(zhuǎn)染（ transfection）：裸露的病毒 DNA或 RNA感染寄主細胞的過程。但反應(yīng)速度慢，僅為粘接法的 1%， ? T4DNA連接酶用量大，為粘接法的 1030倍。 ? 優(yōu)缺點：是 DNA重組中最簡單的一種方法，任何齊平末端外源 DNA片段及載體之間均可以進行重組。 ? 方法：在 T4DNA連接酶的作用下 — 將不同聯(lián)接器聯(lián)接到目的基因的兩端 —— 經(jīng)兩種不同的限制酶切割后，再與載體重組。 ? 若載體和目的基因中間存在裂口，則也可產(chǎn)生同聚作用，退火時將產(chǎn)生復(fù)雜而無感染力的重組分子，影響轉(zhuǎn)化率。 ? 同聚物接尾法：在載 DNA及目的基因兩端分別接上能相互配對的同一個堿基聚合單鏈的重組過程。 ? 定向克隆法 P26：將目的基因按正確的方向插入載體的方法。 ? 方法： ? 插入滅活法：將外源基因插入選擇性標記使其滅活的方法 。以期這種外源性的目的基因能在受體細胞內(nèi)正確表達。 ? PCR的操作體系中含有：雙鏈模板 DNA（即目的基因）、熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶；一對引物和合成時所需要的原材料（ dNTP） ? 方法：高溫變性（雙鏈模板 DNA在 900950加熱 30120分鐘）； ? ? 低溫退火（ 5060 ℃ ） ? ? ? 適溫延伸（ 72 ℃ ） ? 如 此再重復(fù)循環(huán)，則目的 DNA片段的數(shù)量就呈指數(shù)性擴增。 ? ： 聚合酶鏈技術(shù)（ PCR） ? 聚合酶鏈技術(shù)（ PCR）是 1985年美國加利福尼亞的 Mullis等到人開發(fā)的一項專利技術(shù)。 ? 原因（ P23）： ? 方法：與目的基因的 mRNA為模板 —— 借助逆轉(zhuǎn)錄酶合成互補雙鏈 DNA分子，即 cDNA（單鏈） —— 再在DNA聚合酶的作用下合成雙鏈 DNA片斷 —— 與適當(dāng)?shù)妮d體結(jié)合后轉(zhuǎn)入受體菌 —— 擴增為 cDNA文庫 —— 采用適當(dāng)?shù)姆椒◤?cDNA文庫中篩選出目的基因。 ? 逆轉(zhuǎn)錄法： ? 逆轉(zhuǎn)錄法即利用逆轉(zhuǎn)錄酶由 mRNA逆轉(zhuǎn)錄合成 的方法。它是將一種生物的基因儲存在可以長期保存的重組體中。 ? 缺點：反應(yīng)專一性不強，副反應(yīng)多，合成片段越長分離純度化困難，產(chǎn)率越低，而且合成能力有限一般局限于 150200bp。 ? 方法： ? 物理法： ? 原理是從幾個方面來利用核酸 DNA雙螺旋之間存在著堿基 G和 C 配對， A和 T配對的特性差別，以達到生物基因分離目的基因的目的。 ? 外源基因：把插入到載體內(nèi)的那個特定的 DNA片斷。因此，任何 DNA克隆都包括四個步驟： ? 獲取載體裁 DNA和目的基因 —— 把目的基因和