基因工程研究策略和實(shí)踐-資料下載頁
2025-09-11 20:49本頁面
【正文】 使用與目的 DNA互補(bǔ)的探針鑒別陽性轉(zhuǎn)化菌 菌落原位雜交法篩選 復(fù)印至硝酸纖維素膜上 用 NaOH菌體裂解 DNA變性 雜交 放射自顯影 32PcDNA 與放射性 cDNA雜交的菌落的斑點(diǎn) 細(xì)菌菌落 單鏈 DNA結(jié)合到膜上 5. DNA測(cè)序 測(cè)序：確定 DNA鏈上確切的堿基順序 方法：對(duì)初步篩選的陽性重組子，擴(kuò)增后抽提質(zhì)粒，酶切回收片斷，進(jìn)行 DNA測(cè)序確認(rèn)。 依據(jù)抗原、抗體特異性結(jié)合反應(yīng)的原理，以單克隆抗體對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行特異性檢測(cè)。 六、目的 DNA在受體細(xì)胞 中的表達(dá) 基因工程表達(dá)系統(tǒng) 大腸桿菌系統(tǒng) 枯草桿菌系統(tǒng) 酵母細(xì)胞系統(tǒng) 昆蟲細(xì)胞系統(tǒng) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng) 原核表達(dá)系統(tǒng) 真核表達(dá)系統(tǒng) 基因工程操作的主要步驟 載體 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 目的基因（外源基因） 基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物 限制酶消化 開環(huán)載體 DNA 目的基因 連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染 帶重組體的宿主 篩選 表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交 重組 DNA技術(shù)操作過程可形象歸納為 小 結(jié) 分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體 接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體菌 篩 篩選重組體 基因工程的實(shí)踐 乙肝病毒在體外細(xì)胞培養(yǎng)基中并不能生長，因此第一代的乙肝疫苗是從病毒攜帶者的肝細(xì)胞質(zhì)膜上提取出來的。雖然這種質(zhì)膜來源的疫苗具有較高的免疫原性，但其大規(guī)模生產(chǎn)受到病毒表面抗原來源的限制，而且提取物需要高度純化，純化過程中往往會(huì)發(fā)生失活現(xiàn)象。此外，最終產(chǎn)品還必須嚴(yán)格檢驗(yàn)其中是否混有病人的致病病毒。所有這些工序?qū)е轮圃斐杀靖呔硬幌?，因此這種傳統(tǒng)的乙肝疫苗生產(chǎn)方法不能滿足幾億接種人群的需求。 乙醇氧化酶基因(aox1)啟動(dòng)子 可幫助該質(zhì)粒整合到特定染色體位點(diǎn)的序列 (3’ aox1) His合成過程中所需的組氨醇脫氫酶基因 (his) 圖 1012 宿主采用組氨醇脫氫酶缺陷型 (HIS4－ )的 ，經(jīng)雙交換整合重組后，染色體上的 aoxl丟失，而整合入aoxl啟動(dòng)子 — HBsAgaoxl終止子及加 poly(A)信號(hào)序列、his4和 339。aox1。整合后的細(xì)胞可在不含 His的培養(yǎng)基上生長 ? 在酵母細(xì)胞中，這種蛋白能像在受乙肝病毒侵染的人體細(xì)胞中那樣，組裝成多亞基 的復(fù)合物，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體。這個(gè)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)十分穩(wěn)定，在含甲醇的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 200h后仍不會(huì)發(fā)生改變。將重組菌置于 240L發(fā)酵罐中，其表達(dá)量相當(dāng)于約 9 l06劑疫苗。 基因工程的實(shí)踐 2. 彌漫性掌跖角化病患者 KRT9突變對(duì)中間絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的影響 ? 為了研究其中 3個(gè)突變（ N160S、 L167S、A176P）對(duì)中間絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的影響，就要構(gòu)建 N160S、 A176P、 L167S的表達(dá)載體，觀察它們?cè)诩?xì)胞內(nèi)的定位和動(dòng)態(tài)變化。 ? 從皮膚 cDNA文庫和患者基因組 DNA 中擴(kuò)增出 KRT9的野生型和突變型，將其克隆至pEGFPN1質(zhì)粒中，分別轉(zhuǎn)染了 Hela細(xì)胞和 Hacat細(xì)胞。
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