【正文】 ）lacZAmN2H?片段片段COOH?片段片段lacZXgalLac Z藍色化合物藍色化合物Xgalα互補（藍白篩選）（（ LacZ基因基因 N端序列）端序列） 插入片段插入片段（（ LacZ基因失活基因失活））LacZ基因基因 C端序列端序列LacZ酶酶Southern印跡（ 3）分子雜交法 原位雜交 當溶液中的 DNA分子 經(jīng)高溫或高 pH處 理后， DNA雙鏈 分子 變 性 產(chǎn) 生兩條 單鏈 ，如果將溫度逐 漸 下降或 pH恢復(fù)到中性， 單鏈 會按照堿基互 補 配 對 的原 則 ，重新形成氫鍵 恢復(fù)到原來的雙 鏈結(jié)構(gòu)。如果兩條 單鏈 的來源不同，只要它 們 之 間 的堿基 順序同源互 補 或者部分同源互補 ，在條件適宜 時 ，就可以全部或部分復(fù)性 —— 分子 雜交。99原位雜交技術(shù)將 標記 探 針 與 細 胞或 組織 切片中的核酸 進 行 雜 交， 進 而檢測 特異的 DNA或 RNA序列。 細胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNADNARNADNA三 類雜 交 RNARNA 優(yōu)點： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細胞的形態(tài)，因而更能準確地反映組織細胞的功能狀態(tài)。以特異序列為探針鑒定 rDNA在染色體上的分布 雞的 β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學方法 重組 DNA技術(shù)操作過程為： 小結(jié)分 分離目的基因 切 限制酶切目的基因與載體接 拼接重組體 轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)入受體細胞篩 篩選重組體 重組 DNA技術(shù)操作的主要步驟載體質(zhì)粒 噬菌體 病毒目的基因（外源基因）基因組 DNA cDNA 人工合成 PCR產(chǎn)物限制酶消化開環(huán)載體 DNA 目的基因連接酶重組體轉(zhuǎn)化 體外包裝，轉(zhuǎn)染帶重組體的宿主篩選表型篩選 酶切電泳鑒定 菌落原位雜交表達體系的建立：216。表達載體的構(gòu)建216。受體細胞的建立216。表達產(chǎn)物的分離純化（六）克隆基因的表達216。標準： 選擇標志 強啟動子 翻譯調(diào)控序列 多接頭克隆位點216。 ：不宜表達真核基因組 DNA；不能加工表達的真核蛋白質(zhì)；表達的蛋白質(zhì)常形成不溶性包涵體 (inclusionbody) ；很難表達大量可溶性蛋白。1.原核表達體系 ( )大鼠胰島素原 cDNA的表達和分泌真核基因在原核系統(tǒng)表達的困難及其解決方法將真核基因克隆到 1個強大的原核 promotor和 SD的下游，使真核基因處于原核啟動子的控制之下，轉(zhuǎn)錄物由于原核 SD能與核糖體 rRNA結(jié)合，可在原核表達 .這是克服 2困難的好辦法。真核分離出 mRNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA， cDNA有完整的編碼順序，但無內(nèi)含子。采用偽裝辦法：將真核基因插到原核基因某密碼之后，其翻譯產(chǎn)物 N端有原核多肽，這樣表達的融合蛋白，可躲避細菌蛋白酶降解作用。 RNApol不能識別真核的不能識別真核的promotor，故真核基因不能被，故真核基因不能被該酶轉(zhuǎn)錄該酶轉(zhuǎn)錄 . mRNA缺乏缺乏 SD序序列列 ,不能結(jié)合到細菌核糖體不能結(jié)合到細菌核糖體rRNA,因此不能被翻譯成蛋白因此不能被翻譯成蛋白 . ,而原核細胞而原核細胞缺乏真核細胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng)缺乏真核細胞轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng) ,成熟的成熟的 mRNA不能形成不能形成 ,不能表不能表達真核蛋白達真核蛋白 穩(wěn)定穩(wěn)定 ,易被細菌蛋白酶降解易被細菌蛋白酶降解 .216。優(yōu)點： 可表達克隆的 cDNA及真核基因組 DNA可適當修飾表達的蛋白質(zhì)表達產(chǎn)物分區(qū)域積累216。缺點： 操作技術(shù)難、費時、經(jīng)濟216。轉(zhuǎn)染 —— 將表達載體導(dǎo)入真核細胞的過程方法： 磷酸鈣轉(zhuǎn)染DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染電穿孔 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染 顯微注射 （酵母、昆蟲、哺乳類動物細胞）表達載體 pFASTBACI的物理圖譜一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆根據(jù)基因定位克隆之 ,并研究其性質(zhì)，而認識疾病的分子機制。216。疾病基因發(fā)現(xiàn) :脆性 X綜合征Kallmann綜合征第三節(jié)重組 DNA技術(shù)與醫(yī)學的關(guān)系DNA Rebination Technique is Closly Related with Medicine脆性 X綜合癥（ Fragile X syndrome） 常見的遺傳性智力低下綜合征，是 X連鎖不完全顯性遺傳病，其發(fā)病機理是脆性 X智力低下 1號基因 5′端非翻譯區(qū)（CGG） n三核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列大量擴增和 CpG島異常甲基化，引起脆性 X智力低下 1號基因失活，導(dǎo)致脆性 X智力低下1號蛋白的缺失引起智力低下。 從第一個重 組 克隆插入片段的一端分離出一個片段作 為 探 針 從文 庫 中 篩選 第二個重 組 克隆， 該 克隆插入片段含有與探 針 重疊 順 序和染色體的其他 順 序。從第二個重 組 克隆的插入片段再分離出末端小片段 篩選 第三個重 組 克隆，如此重復(fù)，得到一個相 鄰 的片段，等于在染色體上移了一步，故稱之 為 染色體步移（Chromosome Walking）二、生 物制藥216。利用基因工程生產(chǎn)有藥用價值的蛋白質(zhì)、多肽產(chǎn)品已成為當今世界一項重大產(chǎn)業(yè)，并將有望成為 21世紀的支柱產(chǎn)業(yè)。 216。美國 EliLilly公司于 1982年首先利用重組DNA技術(shù)合成人胰島素并投放市場，標志著生物工程藥物時代的開始。迄今為止，已有50多種基因工程藥物上市，近千種處于研發(fā)狀態(tài)，形成一個巨大的高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生了不可估量的社會效益和經(jīng)濟效益。重組 DNA醫(yī)藥產(chǎn)品產(chǎn) 品 功 能組織胞漿素原激活劑 抗凝血液因子 VIII 促進凝血顆粒細胞 巨噬細胞集落剌激因子 剌激白細胞生成促紅細胞生成素 剌激白細胞生成生長因子 (bFGF,EGF) 刺激細胞生長與分化生長素 治療侏儒癥胰島素 治療糖尿病干擾素 (?1b,?2a,?2b,?) 抗病毒感染及某些腫瘤白細胞介素 激活、剌激各類白細胞超氧化物歧化酶 抗組織損傷單克隆抗體 利用其結(jié)合特異性進行診斷試驗、腫瘤導(dǎo)向治療乙肝疫苗 (CHO,酵母 ) 預(yù)防乙肝口服重組 B亞單位菌體霍亂菌苗 預(yù)防霍亂基因診斷 (geic diagnosis)是 利用分子生物學及分子遺傳的技術(shù)和原理，在 DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。 又稱 DNA診斷 三、基因診斷與治療（一）基因診斷的概念216?；具^程： 區(qū)分或鑒定 DNA的異常分離、擴增待測的 DNA片斷? 能正確擴增靶基因；? 能準確區(qū)分單個堿基的差別；? 本底或噪聲低，不干擾 DNA的鑒定 。? 便于完全自動化操作，適合大面積、大人群普查。216。標準：（二）基因治療的概念216。定義基因治療 (genetherapy)是向有功能缺陷的細胞補充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補償其基因的缺陷，從而達到治療的目的。216。方式體細胞基因治療 (somaticcellgenetherapy)性細胞基因治療 (germlinegenetherapy)1.產(chǎn)前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性四、遺傳疾病的預(yù)防目錄演講完畢，謝謝觀