第十七章基因重組和基因工程習(xí)題-資料下載頁
2025-03-25 06:55本頁面
【正文】 ，還能利用本身的調(diào)控系統(tǒng)，使外源基因在宿主細(xì)胞中復(fù)制并表達。２、（1）限制性核酸內(nèi)切酶：識別并特異切割DNA堿基序列；（2）DNA polⅠ：催化缺口平移，制備高比度DNA探針；（3）Klenow片段：合成cDNA第二條鏈，補齊或標(biāo)記雙鏈DNA3′端；（4）TaqDNA聚合酶：DNA體外擴增(PCR)；（5）逆轉(zhuǎn)錄酶：催化合成cDNA；(6) T4DNA聚合酶：聚合補平或標(biāo)記DNA平末端或3′凹端等；（7）DNA連接酶：催化2條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵；（8）大腸桿菌DNA連接酶： 應(yīng)用于黏端DNA或切口間連接；（9）T4DNA連接酶：應(yīng)用于黏性或平末端DNA的連接；（10）末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶：給載體或cDNA加上互補的同聚尾、加標(biāo)記物；（11）堿性磷酸酶：防止載體自身連接、32P標(biāo)記5′端；（12）T4多核苷酸激酶：5′端磷酸化、5′端標(biāo)記放射性核素。３、（1）分離制備目的基因——“分”；（2）切割目的基因和載體——“切”；（3）目的基因與載體的連接——“接”；（4）將重組DNA導(dǎo)入宿主細(xì)胞——“轉(zhuǎn)”；（5）篩選并鑒定含重組DNA分子的受體細(xì)胞克隆——“篩”；（6）克隆基因在受體細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制或表達——“表”。 ４、（1） 制備基因組文庫；（2） 構(gòu)建cDNA文庫；（3） PCR擴增目的基因；（4） 人工合成DNA技術(shù)。５、 ⑴ 黏性末端連接：將靶基因片段和載體DNA經(jīng)相同的限制酶分別切割，使它們兩端產(chǎn)生相同的黏性末端。然后經(jīng)黏性末端堿基配對，再經(jīng)DNA連接酶作用，共價連接成新的重組DNA分子；⑵ 平頭末端連接：將平末端的DNA分子在T4DNA連接酶催化下，使DNA分子的3′OH和5′P進行共價結(jié)合； ⑶ 人工接頭法： 是指利用人工接頭加在平端DNA片段的兩端，然后用相應(yīng)限制酶切割人工接頭以產(chǎn)生黏性末端，再與帶相同黏性末端的載體相連；⑷ 同源多聚尾連接法：在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶催化下，在線型載體分子的兩端加上單一核苷酸如dG組成的多聚尾；而在目的DNA分子的兩端加上dC尾，兩者混合退火，然后經(jīng)DNA聚合酶Ⅰ或Klenow填補裂口處缺失的核苷酸，再通過DNA連接酶修復(fù)成環(huán)狀的雙鏈DNA。限制性核酸內(nèi)切酶(RE)是由細(xì)菌產(chǎn)生的一類能特異識別雙鏈DNA中的特定堿基序列，并在識別位點切割磷酸二酯鍵的核酸內(nèi)切酶(簡稱限制酶)。限制酶的識別和切割位點通常是4～8個bp長度且具有回文序列的DNA片段，主要產(chǎn)生5′突出、3′突出的黏性末端或平端。當(dāng)一個樣本DNA被一個特定的限制酶切割后，可以產(chǎn)生一批相同堿基序列的DNA片段，進而可以用于基因重組、克隆、核酸分子雜交與序列分析等。質(zhì)粒是獨立于細(xì)菌染色體之外，能自主復(fù)制的共價閉合環(huán)狀雙鏈DNA。經(jīng)過人工構(gòu)建的載體，不但能與外源基因相連接，而且質(zhì)粒含有復(fù)制起始原點(ori)，此起始點與順式作用調(diào)控元件構(gòu)成一個復(fù)制子(復(fù)制區(qū)內(nèi))，能借助宿主細(xì)菌染色體DNA復(fù)制所用的同一套酶系獨立地進行自我復(fù)制、克隆。 7 / 7
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