【正文】 ? 引物或 dNTP的量不足。 ? DNA聚合酶中途失活。 * 128 四 . PCR的優(yōu)化 * 129 變性溫度和時(shí)間 ? 變性不完全 —— 失敗。 ? 一般 94℃ ? 基因的 G和 C多，可提高變性溫度 . ? 過(guò)高或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，酶活性會(huì)損失 。 * 130 退火 (annealing) 溫度與時(shí)間 ? 通常 3755℃ 、 30s~2min。 ? 引物 G、 C含量高、 長(zhǎng)度長(zhǎng)并與模板完全配對(duì)時(shí)，可提高溫度。 ? 溫度越高，產(chǎn)物特異性越高。 * 131 ? 溫度應(yīng)通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定 . ? 每次實(shí)驗(yàn)溫度遞增(減 )2℃ . ? 可使用梯并 PCR儀 . * 132 ? 延伸的溫度與時(shí)間 ? 常用 72℃ . ? 時(shí)間：對(duì)低濃度的、序列長(zhǎng)的 DNA片段，可延長(zhǎng)時(shí)間。 ? 時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，非特異性增加。一般在擴(kuò)增后，需一步較長(zhǎng)時(shí)間的延伸反應(yīng)。 ? 4 循環(huán)次數(shù) : ? 2530個(gè)足夠。 ? 循環(huán)過(guò)多，非特異性增加 * 133 5 Mg2+濃度 ? [Mg2+]低，產(chǎn)物少 . ? [Mg2+] 高，非特異性高。 * 134 強(qiáng)大擴(kuò)增能力，檢測(cè)敏感 極微量的污染便可導(dǎo)致假陽(yáng)性。 五、 PCR污染及其對(duì)策 * 135 1 污染源 ①、 點(diǎn)樣器和加樣器 ②、離心機(jī) ③、微解剖刀 ④、 濃縮用具 ⑤、電泳裝置 等等。 * 136 2 污染的預(yù)防 ? (1) 隔離不同操作區(qū)： 前處理、后處理在不同隔離工作臺(tái)或房間進(jìn)行。 ? (2) 分裝試劑 ： ? 去離子水、緩沖液、吸頭、離心管等均應(yīng)高壓滅菌。 ? 引物 不能高壓， 用滅菌的去離子水在無(wú)菌條件下配制 。 ? 試劑均應(yīng)在無(wú) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)制備、分裝與貯存。 * 137 (3) 改進(jìn)實(shí)驗(yàn)操作 : ? ① 戴一次性手套操作。 ? ②避免反應(yīng)液的飛濺。 ? ③用一次性移液器或吸頭。 ? (4) 結(jié)果的重演 : ? 反復(fù)驗(yàn)證 * 138 六 . PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法 1 凝膠電泳分析法 ? 瓊脂糖凝膠、 聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 鑒定產(chǎn)物大小，還可以純化擴(kuò)增產(chǎn)物。 2 點(diǎn)雜交 ? 當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時(shí)，用點(diǎn)雜交更合適 3 序列測(cè)定 ? 最準(zhǔn) * 139 4 其他： 微孔板夾心雜交法、 PCRELISA法、 顏色互補(bǔ)分析法、 單一核苷酸引物延伸法 PCROLA * 140 第五節(jié) 凝膠電泳分析 DNA片段 Analysis of DNA fragment by gel electrophoresis 一、核酸電泳的原理： 1. 核酸是兼性離子，具有等電點(diǎn) (DNA 4~， RNA 2~)。在中性或堿性緩沖系統(tǒng)中帶負(fù)電 。 ? 電泳： 在外電場(chǎng)作用下，由于離子所帶電荷大小和性質(zhì)不同，其泳動(dòng)方向和速率也不同，從而達(dá)到分離的目的。 * 141 OH OH OH OH OH OH OH OH H + H + H + H + H + H + H + H + 兼性離子 帶正電荷離子 帶負(fù)電荷離子 BaseH + BaseH H + BaseH + + H H H + + + + H BaseH + BaseH H + BaseH ++* 142 電泳遷移率與 DNA的構(gòu)型和大小相關(guān)。 大小相同 ： ?超螺旋結(jié)構(gòu)最快， ?環(huán)狀結(jié)構(gòu)次之， ?線性結(jié)構(gòu)最慢。 構(gòu)型相同 ： ?越小越快。 * 143 凝膠 ?固體 DNA不會(huì)丟失 ?固體 提供阻力 * 144 DNA可以被染色觀察 ? 可見光下 DNA無(wú)色。 ? DNA被 EB染色后，紫外光照射可發(fā)光，可以檢測(cè)和分析。 * 145 1 2 實(shí) 例 * 146 二、電泳方法： Agarose gel electrophoresis 瓊脂糖凝膠電泳 (分離范圍 : 70bp80kb） Polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) 聚丙烯酰胺凝膠電泳 (分離范圍 : 6bp1kb) * 147 瓊脂糖凝膠電泳 * 148 （ 1）、緩沖溶液（ Buffer） ? 一種溶液可同時(shí)用于電泳和凝膠制備。 常用： ? TAE （ Tris乙酸 EDTA） ? TBE （ Tris硼酸 EDTA），較粘稠， * 149 (2)、凝膠中瓊脂糖的含量： ? 含量高，凝膠密度大，分析 DNA片段小， ? 反之，分析 DNA片段大 ? 含量要依據(jù) DNA大小確定，一般用 1%。 * 150 凝膠濃度過(guò)大時(shí) * 151 凝膠濃度適中 * 152 凝膠濃度過(guò)小 * 153 高濃度凝膠，適合小分子DNA * 154 低濃度凝膠，適合大分子DNA * 155 DNA片段大?。? kb） 瓊脂糖含量 （ %） 80 * 156 (3)、凝膠的配置 ? 例如配制 1%的凝膠： ? 稱 20mL TAE緩沖溶液，混均， ? 加熱熔化（微波爐）。 注意：此時(shí)溶化的凝膠易沸騰噴出。 ? 倒入制膠平臺(tái)上，插入梳子。 ? 冷卻凝固后，拔出梳子，留出樣品孔。 * 157 (4)、加 DNA樣品 ? 電泳槽加滿 TAE緩沖溶液，放入制好的凝膠，浸入溶液中。 ? DNA樣品與 上樣緩沖液 (含甘油 )混合后加入凝膠中上樣孔內(nèi)（加入量在孔的 2/3以下）。 * 158 (5)、電泳 ? 加樣孔在負(fù)極，接通電源， 90v 電壓電泳。 Positive pole negative pole * 159 (6)、染色與紫外觀察 ? 電泳完成，取出凝膠， 浸入 EB溶液 ，染色1030 min后，在 302nm紫外光 下觀察。 ? 注意事項(xiàng)： ? 紫外可傷眼睛皮膚等， 應(yīng)戴面罩 。 ? EB是很強(qiáng)的 誘變劑 ，應(yīng) 帶手套。 * 160 (7)、 DNA片段大小的確定 ? 將已知大小的 DNA marker與待測(cè)的 DNA片段在同一板膠上電泳，根據(jù) DNA marker的大小來(lái)推斷待測(cè) DNA大小。 * 161 564 831 1375 1904 DNA Marker 待測(cè) DNA DNA片段大小的確定 注意：待測(cè) DNA與 Marker DNA的構(gòu)型一定相同 * 162 1 2 564 831 947 1375 1584 1904 750 830 實(shí) 例 * 163 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ PAGE） * 164 Section 6 DNA fragments link 一、 DNA ligase DNA連接酶可催化雙鏈 DNA片段 靠近的3`羥基末端與 5`磷酸末端形成磷酸二酯鍵而連接的。 * 165 常用的 DNA連接酶 ? E. coli DNA ligase：只連接黏末端。 ? T4 DNA ligase：可連接粘末端和平末端，反應(yīng)需要 ATP輔助。 * 166 5’ ……ATCGCGAT GAATT CGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTA C TTAAGCGCTA …… 5` OH OH P P 3` 5` 3` 5` 5’ ……ATCGCGAT GAATTCGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTA CTTAAGCGCTA …… 5 ligase * 167 * 168 二、連接方法 1. 連接粘末端 . ? 將 ddH2O， buffer，兩 DNA片段， T4 DNA ligase混合 12℃ 下 8 h . ? 只能用 T4 DNA ligase. * 169 5’ ……ATCGCGAT CGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTA GCGCTA …… 5` OH OH P P 3` 5` 3` 5` 5’ ……ATCGCGATGCGAT …… 3’ 3’ ……TAGCGCTACGCTA …… 5 T4 DNA ligase ATP * 170 課后習(xí)題 1. 說(shuō)明 PCR的反應(yīng)體系的組成及基本過(guò)程。 2. 以 EcoR I 為例說(shuō)明限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的基本特點(diǎn)。 3. 為什么 DNA可以采用凝膠電泳法進(jìn)行分離分析 ? 演講完畢，謝謝觀看！