2第二章_基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)-資料下載頁(yè)
2025-03-10 14:13本頁(yè)面
【正文】 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 引物 （ 1） T4 DNA聚合酶的性質(zhì) 3. T4 DNA聚合酶 從 T4噬菌體感染后的大腸桿菌培養(yǎng)物中分離純化，由 噬菌體基因 43編碼。 有 5’ ?3’ 聚合酶活性和 3’ ?5’ 外切酶活性（降解單鏈更快）。 ① 來(lái)源 ② 酶活性 ③ 特點(diǎn) A 當(dāng)沒(méi)有 dNTP時(shí)， T4 DNA聚合酶行使 3’?5’外切酶功能，制造出 3’隱蔽端。 B 如果只有一種 dNTP，則降解到該 dNTP的位置。 C 在四種 dNTP均存在時(shí)，聚合活性占主導(dǎo)地位。 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ T4 DNA聚合酶 無(wú) dNTPs T4 DNA聚合酶 有 dNTPs 5’ 5’ （ 2） T4 DNA聚合酶的用途 標(biāo)記末端（取代合成法或置換合成法） 用 3’ ?5’ 外切酶活性作用于 所有末端形式的 3’端 （平端、 3’ 隱蔽端、 5’ 隱蔽端）制造出 3’ 隱蔽端。 再利用它的 5’ ?3’ 聚合酶活性補(bǔ)平，并加入放射性標(biāo)記的 dNTP。 ① 補(bǔ)平隱蔽末端 ② DNA 3’ 末端標(biāo)記 4. T7 DNA聚合酶 （ 1）來(lái)源 從 T7噬菌體感染大腸桿菌細(xì)胞中純化出來(lái)的，由兩個(gè)亞基組成： ① T7噬菌體基因 5編碼的大亞基： T7噬菌體 5蛋白 有 5’ ?3’ 聚合酶和 3’ ?5’ 外切酶活性。 ② 大腸桿菌編碼的小亞基： 硫氧還蛋白 增加大亞基對(duì) 模板的親和性 。 （ 2） T7 DNA聚合酶的特點(diǎn) ① 持續(xù)合成能力強(qiáng) 一旦與模板結(jié)合就會(huì)不間斷地合成互補(bǔ)鏈。 ② 3’ ?5’ 外切酶活性高 單鏈和雙鏈都能降解。 ③ 不受 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響 其它 DNA聚合酶受 DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的阻礙 ② 進(jìn)行末端標(biāo)記 ① 催化大分子量 DNA為模板的合成 如 M13噬菌體 ③ 補(bǔ)平隱蔽末端 （ 3） T7 DNA聚合酶的用途 合成 補(bǔ)平 3’ 隱蔽末端； 水解 修平 3’ 突出末端。 5. 修飾后的 T7 DNA聚合酶 （ 1） T7DNA聚合酶的化學(xué)修飾 去除 3’ ?5’ 外切酶活性，使 DNA聚合能力和聚合速率提高了 3倍。 （ 2）修飾后的 T7 DNA聚合酶的用途 ① DNA測(cè)序 雙脫氧法。 ② 標(biāo)記 DNA 3’ 隱蔽末端 ③ 更有效地補(bǔ)平末端 6. 逆轉(zhuǎn)錄酶 最普遍使用的是來(lái)源于 鳥類骨髓母細(xì)胞瘤病毒（ avian myeloblastosis virus, AMV）： 依賴 RNA的 DNA聚合酶（ RNA指導(dǎo)的 DNA聚合酶）。 （ 1）來(lái)源 RNA腫瘤病毒。 （ 2） AMV的性質(zhì) 由 ?和 ?兩條多肽鏈組成，最適反應(yīng)溫度為 41～ 45℃ ① ?鏈 有反轉(zhuǎn)錄活性和 RNaseH活性。 RNaseH： 以 5’ ?3’ 或 3’ ?5’ 方向特異地水解 RNADNA雜交雙鏈中的 RNA鏈 。 RNaseH RNA DNA RNA DNA （ 3）逆轉(zhuǎn)錄酶的用途 ② ?鏈 RNADNA雜交雙鏈中 5’ ?3’ DNA外切酶活性。 ① 合成 cDNA 以 oligo dT為引物（與 mRNA的 polyA尾巴互補(bǔ)結(jié)合）。 AAAAA TTTTT 5’ 3’ mRNA 5’ cDNA ② 合成 DNA探針 用隨機(jī)引物（ random primer）或 oligo dT做引物。 隨機(jī)引物： 隨機(jī)順序形成的寡聚 DNA片斷。 （理論上它能與各種序列的模板結(jié)合） 演講完畢，謝謝觀看！
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