2第二章_基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)(編輯修改稿)
2025-03-28 14:13 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ATCA3’ 3’ACTAG?T5’ 5’A?GATCT3’ 3’TCTAG?A5’ Bgl Ⅱ 5’U?GATCY3’ 3’YCTAG?U5’ Xho Ⅱ U代表嘌呤； Y代表嘧啶。 [6] 同尾酶 (Isocaudamers） 限制性內(nèi)切酶的識別和酶切活性一般在一定的溫度、離子強(qiáng)度、 pH等條件下才表現(xiàn)最佳切割能力和位點的專一性。 如果改變反應(yīng)條件就會影響酶的 專一性和切割效率 ，稱為星號（ *）活性。 所以一般使用專一的反應(yīng)緩沖液。 影響限制酶的酶活性的因素 星號（ *）活性 EcoR I和 BamH I等都有 *活性。 在低鹽、高 pH（ 8）時可識別和切割 GAATTA、 AAATTC、 GAGTTC等 GAATTC EcoR I： 使用的時候要特別注意！ 7 誘發(fā)星號（ *）活性的原因 ⅰ ）高甘油含量 ⅱ ）內(nèi)切酶用量過大 ⅲ ）低離子強(qiáng)度 ⅳ ）高 pH ⅴ ）含有機(jī)溶劑，如乙醇 ⅵ ） Mn2+、 Mg2+、 Cu2+、 Zn2+等二價陽離子的存在 酶量不宜過多，盡量遵循生產(chǎn)商推薦的反應(yīng)條件 從細(xì)菌 DNA環(huán)化現(xiàn)象推測，必定存在一種能把兩條 DNA雙鏈連接到一起的酶。 第二節(jié) DNA 連接酶 一、 DNA連接酶（ ligase)的發(fā)現(xiàn) DNA復(fù)制一定有斷口 DNA連接酶 : 一種能夠催化在兩條 DNA鏈之間形成 磷酸二酯鍵 的酶 1967年，世界上數(shù)個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了一種能夠催化在 2條 DNA鏈之間形成 磷酸二酯鍵 的酶，即 DNA連接酶。 （ 1）大腸桿菌連接酶 1. 兩種共價連接 DNA限制片段的 DNA連接酶 連接 粘性末端 ，準(zhǔn)確性高 ,NAD+ 齊平末端，效率低 二、 DNA ligase的特點 （ 2） T4噬菌體的連接酶 不但能連接粘性末端；還能連接齊平末端 DNADNA RNARNA DNARNA ATP （ 1）必須是 雙鏈 DNA （ 2） DNA3’ 端有游離的 OH， 5’ 端有一個磷酸基團(tuán)（ P） （ 3）需要 能量 ATP 或 NAD+ 2. DNA連接酶催化的連接反應(yīng)特點 （ 4）只能連接缺口（ nick）， 不能連接裂口（ gap）。 是兩條鏈－ 因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。 OH P 是相鄰的－ 因此只能封閉 gap gap NO Nick OK 三 、 DNA連接酶的反應(yīng)條件 TrisHCl 50 100 mM， pH MgCl2 10 mM ATP 1 mM DTT 5 mM Volume 10 20 ml T T 4 15 ℃ ， 4 16 hr 1. 反應(yīng)溫度 理論 37 ℃ 黏性末端： 12～ 16℃ 平頭末端： 10～ 20℃ 2. ATP濃度 一般， ATP最適的終濃度為 ATP濃度高至 5mmol/L，影響平頭末端的連接 ATP濃度高至 ，抑制粘性末端及平頭末端的連接。 四、影響連接反應(yīng)的因素 3 連接酶的濃度： 平末端 DNA分子的連接反應(yīng)中，最適 1～ 2個單位。 粘性末端 DNA片段之間的連接， 。 時間： 16 ℃ 4小時 4 ℃ 過夜 增加插入片段與載體的接觸機(jī)會，減少同一個分子末端自我連接的
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