基因工程3-3基因操作的工具酶(編輯修改稿)
2025-02-07 14:59 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 (2)將 DNA的 3’延伸末端切成平末端(3) 以取代反應(yīng)標(biāo)記帶有 3’延伸末端或平末端的dsDNA片段(4) 以部分消化 dsDNA法標(biāo)記 DNA片段作為雜交探針（鏈特異的探針） 逆轉(zhuǎn)錄酶是一種有效的轉(zhuǎn)錄 RNA成為 DNA的酶，又稱 RNA依賴的 DNA聚合酶，其產(chǎn)物 DNA稱 cDNA，即互補DNA。1. 逆轉(zhuǎn)錄酶也是一個多功能酶：(1) RNA依賴的 DNA聚合酶 以 RNA鏈為模板，以帶有 3’OH 末端的 DNA片段為引物，沿 5’ ? 3’ 方向合成 DNA鏈。 幾乎所有真核生物的 mRNA分子 3’ 末端都有一段 Poly A，故加入寡聚 dT后， mRNA就可以成為逆轉(zhuǎn)錄酶很好的模板，由此可合成 cDNA。(2)DNA依賴的 DNA聚合酶以 ssDNA為模板，以帶有 3’OH末端的 DNA片段為引物，沿 5’?3’方向合成 DNA鏈?？稍谛潞铣傻?DNA鏈上合成另一條互補 DNA。(3)外切 RNA酶活性底物是 RNADNA雜交分子中的 RNA鏈，其水解方向有兩種：*從 RNA鏈 5’末端外切：稱 5’?3’外切 RNA酶*從 RNA鏈 3’末端外切：稱 3’?5’外切 RNA酶2. 逆轉(zhuǎn)錄酶在基因工程中的應(yīng)用：主要用途是轉(zhuǎn)錄真核生物的 mRNA成為 cDNA，從而制備基因片段。3. 商品化的逆轉(zhuǎn)錄酶有兩種：(1)禽成髓細(xì)胞瘤病毒（ AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶(2)Moloney鼠白血病病毒（ MoMLV）逆轉(zhuǎn)錄酶 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶雖能更有效地拷貝復(fù)雜的mRNA，但它有很強的外切 RNA酶活性。而 MoMLV逆轉(zhuǎn)錄酶的外切 RNA酶活性較弱，更有利于制備全長的 cDNA。兩種逆轉(zhuǎn)錄酶均無 3’?5’外切 DNA酶活性，故不具備校對功能，在高濃度 dNTP和 Mn2+存在下，容易出現(xiàn)核苷酸錯誤摻入。 DNA和 RNA的修飾酶 核酸酶 SI1. 作用特點：此酶是從米曲霉（ Aspergillus oryzae）中提取的，可降解 ssDNA或 ssRNA，又稱單鏈特異性酶，其降解產(chǎn)物是 5’磷酸末端的單或寡核苷酸片段。核酸酶 SI對 DNA底物的活性比對 RNA強。高濃度的核酸酶 SI可從缺口（ nick）或小裂縫（ gap）處降解dsDNA。 2. 作用條件：需要 Zn2+作為輔助因子，最適 pH是 ，這是與基因工程的其它工具酶不同的兩個特點。3. 在基因工程中的應(yīng)用：由于核酸酶 SI能從 DNA片段中切除單鏈尾巴，因而在質(zhì)粒的重建和 DNA重組中被廣泛使用。(1) 切除單鏈粘性末端，產(chǎn)生平末端，再用 T4連接酶連接。(2) 切除 cDNA的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶1. 作用特點：
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