基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)-powerpoint演示文稿(編輯修改稿)
2025-01-25 17:43 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體 DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去 5’ P的鏈不能進(jìn)行連接，形成 3’ OH 和 5’ OH 的缺口。 平末端 DNA片斷的連接 1. T4DNA連接酶 2. 用 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 給平末端加上同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶連接。 常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法 同聚物加尾法 用 5’ 末端特異的核酸外切酶處理 DNA片斷 在 A和 B分別中加入 dATP和 dTTP 同聚物尾巴 10~40個(gè)堿基 同聚物加尾法或 T4連接酶的平末端連接法，無(wú)法用原來(lái)的限制酶作特異性的切割，獲得插入片斷進(jìn)行進(jìn)一步的研究。 銜接物連接法 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（ linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。銜接物是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。如： CCGGATCCGG GGCCTAGGCC 將銜接物分子與平末端 DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn) 。 Hpa II Hpa II BamH I 或 Sau3A 銜接物（ linker） 是指用化學(xué)方法合成的一段由 10～ 12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。 雙銜接物： 可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。 銜接物連接法 雙銜接物連接法的基本程序 cDNA鏈的合成 通過(guò) DNA聚合酶合成第二鏈 加入 Sal I銜接物 S I核酸酶作用后的末端單鏈突出序列， 由 Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物 Ecol I 在用 DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆 DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。 DNA接頭（ adapter）連接法： 1978年，美國(guó)康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞 博士發(fā)明的。 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。 粘性末端容易通過(guò)堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì) DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端 5’ P，暴露出 5’ OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。 DNA接頭連接法 熱穩(wěn)定的連接 從嗜熱 高溫 方線菌的菌株中分離出來(lái)的。能在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。 1. 寡核苷酸連接測(cè)定 2. （ oligonucletide ligation assay,OLA） 3. 用兩個(gè)寡核苷酸探針，同已知序列的靶 DNA雜交，探針在靶 DNA分子的位置是相鄰的。 2. 連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ lingase chain reaction,LCR）； 也叫連接擴(kuò)增反應(yīng)（ lingase amplication reaction） 3. 用寡核苷酸探針通過(guò) DNA連接酶的作用擴(kuò)增已知序列的靶 DNA的方法。需要 4種引物， 寡核苷酸連接測(cè)定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G T G A C C T A C C T A G T G A C C T A C C T 待擴(kuò)增的 DNA片斷 P P B B D D 地高辛配基 生物素 磷酸 B B B B D D P P 陽(yáng)性信號(hào) 無(wú)信號(hào) 酶抗生素蛋白 由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵 檢測(cè)單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性 LCR： ligase chain reaction，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 樣品 DNA、探針 (4) 94度變性 DNA聚合酶 常用的 DNA聚合酶： 大腸桿菌 DNA聚合酶、 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ的 Klenow大片斷酶、 T4DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶、 反轉(zhuǎn)錄酶等。 共同點(diǎn)： 把脫氧核糖核苷酸連續(xù)的加到雙鏈DNA分子引物鏈的 3’ OH末端，催化核苷酸的聚合作用，而不發(fā)生從引物模板上解離的情況。 大腸桿菌 DNA聚合酶 DNA聚合酶Ｉ（ PolＩ）、 DNA聚合酶 ?（ Pol ? ）、 DNA聚合酶 ? （ Pol ? ）、 PolＩ和 Pol ? 的主要功能參與 DNA的合成； Pol ? 的功能同 DNA的復(fù)制有關(guān)； PolＩ同 DNA分子克隆的關(guān)系最為密切。 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ： 1957年，美國(guó)的生物學(xué)家 次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種 DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說(shuō)的 DNA聚合酶Ｉ。由polＩ基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)，分子量為 109?1000dal。 DNA聚合酶Ｉ，可以被蛋白酶切割成兩個(gè)片斷，一個(gè)具有全部的 3
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