基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)-powerpoint演示文稿-wenkub.com
2025-12-26 17:43 本頁面
【正文】 2023年 1月 上午 11時(shí) 49分 :49January 23, 2023 1業(yè)余生活要有意義，不要越軌。 11:49:0511:49:0511:49Monday, January 23, 2023 1知人者智，自知者明。 上午 11時(shí) 49分 5秒 上午 11時(shí) 49分 11:49: 楊柳散和風(fēng)，青山澹吾慮。 2023年 1月 23日星期一 上午 11時(shí) 49分 5秒 11:49: 1楚塞三湘接，荊門九派通。 11:49:0511:49:0511:491/23/2023 11:49:05 AM 1成功就是日復(fù)一日那一點(diǎn)點(diǎn)小小努力的積累。 2023年 1月 上午 11時(shí) 49分 :49January 23, 2023 1行動(dòng)出成果，工作出財(cái)富。 11:49:0511:49:0511:49Monday, January 23, 2023 1乍見翻疑夢，相悲各問年。 聚合作用高；失去了 3’ 5’的外切酶活性 靜夜四無鄰，荒居舊業(yè)貧。聚合作用的速率增加了 3倍。 T7DNA聚合酶： 1978年， T7噬菌體的大腸桿菌寄主細(xì)胞中純化出來的一種核酸酶。 主要作用是以 mRNA為模板合成 cDNA；用來對 5’突出末端的 DNA片斷作末端標(biāo)記。如果反應(yīng)物中存在一種 dNTP時(shí)，它的水解作用進(jìn)行到暴露出同反應(yīng)物中唯一的 dNTP互補(bǔ)的核苷酸時(shí)就會(huì)停止。 T4DNA聚合酶和 取代合成法標(biāo)記 DNA片斷 從 T4噬菌體感染的大腸桿菌培養(yǎng)物中純化出的一種特殊的 DNA聚合酶。 DNA片斷末端標(biāo)記： 具有 3’隱蔽末端的帶標(biāo)記得的 DNA片斷 5’ GATCT…3 ’ 3’ A…5 ’ 在反應(yīng)物中加入 Klenow聚合酶 α 32pdGTP,一道溫育后生成： 5’ GATCT…3 ’ 3’ 32p GA…5 ’ 或是同時(shí)加入 α 32pdATP＋ dGTP 5’ GATCT…3 ’ 3’ 32p AGA…5 ’ DNA片斷末端標(biāo)記可以作為用凝膠電泳法測定分子大小的標(biāo)記樣品。 低濃度的 32pdNTPs（ 2 μmol/L ）和高濃度的 dNTPs（ 20 μmol/L ） 一般希望有 30%左右的 32pdNTPs參入 DNA鏈（ DnaseＩ數(shù)量）。 DNA雜交探針的制備 典型的反應(yīng)體系是。但對于底物是雙鏈的 DNA，在具有 dNTPs時(shí)，這種降解活性將會(huì)被 5’ 3’ 的聚合酶活性所抑制 。 DNA聚合酶Ｉ發(fā)揮作用的條件： 底物： 四種脫氧核苷 5’ 三磷酸（ dNTP）； Mg＋＋ 離子 ； 帶有 3’ OH游離基團(tuán)的引物鏈； DNA模板：單鏈，雙鏈（ 糖 磷酸主鍵上有一個(gè) 或多個(gè)斷裂 ）。 大腸桿菌 DNA聚合酶Ｉ： 1957年，美國的生物學(xué)家 次證實(shí)，在大腸桿菌提取物中存在一種 DNA聚合酶，即現(xiàn)在所說的 DNA聚合酶Ｉ。需要 4種引物， 寡核苷酸連接測定 AGTGACCT TCACTGGA A G T G A C C T A G T T A C C T T C A C T G G A T C A C T G G A A G T G A C C T A C C T A G T G A C C T A C C T 待擴(kuò)增的 DNA片斷 P P B B D D 地高辛配基 生物素 磷酸 B B B B D D P P 陽性信號 無信號 酶抗生素蛋白 由于堿基錯(cuò)配不能形成磷酸二酯鍵 檢測單堿基的取代、插入、及缺失而引起的多態(tài)性 LCR： ligase chain reaction，連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。 DNA接頭連接法 熱穩(wěn)定的連接 從嗜熱 高溫 方線菌的菌株中分離出來的。 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。 Hpa II Hpa II BamH I 或 Sau3A 銜接物（ linker） 是指用化學(xué)方法合成的一段由 10～ 12個(gè)核苷酸組成、具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。 銜接物連接法 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（ linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。 而外源片斷的 5’ P能與載體的 3’ OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。 影響連接酶作用的因素 1. 反應(yīng)溫度： 連接缺口的溫度： 37度 連接 粘性末端 的最佳溫度： 4～
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