基因工程的酶學(xué)基礎(chǔ)(編輯修改稿)
2025-02-02 02:35 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 O5’3’5’3’POOOO3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’A TP A D PD N A連接酶缺口 nick和裂口 gap ? 缺口 nick：即在雙鏈 DNA的某一條鏈上兩個(gè)相鄰的核苷酸之間失去一個(gè) 磷酸二酯鍵 所出現(xiàn)的單鏈斷裂，該斷裂 能為 DNA ligase所連接 。 ? 裂口 gap：即在雙鏈 DNA的某一條鏈上 失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸 所形成的單鏈斷裂，該斷裂 不能為 DNA ligase所連接 。 常用 DNA ligase 來源 ? 由大腸桿菌染色體編碼的叫 DNA連接酶 ，即 DNA ligase， 以 NAD+為輔因子 由大腸桿菌 T4噬菌體編碼的叫T4 DNA連接酶，以 ATP為輔因子 ?基因工程中常用的連接酶主要有 ： T4DNA連接酶和大腸桿菌連接酶 ，而以前者為最常用。 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 5180。 5180。 (1) (2) AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 (a)分子間連接 (b)分子內(nèi)連接 (1) (2) AT G C T A TA G C T A T4連接酶 T4連接酶 影響連接酶作用的因素 ?① 反應(yīng)溫度： 連接缺口的溫度： 37度；連接粘性末端的最佳溫度： 4～ 15度 ?② Ｔ 4 DNA連接酶 的用量： ? 平末端 DNA分子的連接反應(yīng)中，最適 1～ 2個(gè)單位。 ? 粘性末端 DNA片斷之間的連接，酶濃度 。 ? ATP的用量 10μmol~1mmol/L之間 ?③提高外源片斷與載體的濃度的比值，（ 10～ 20倍） 3. DNA片斷之間的連接 ?（ 1）具有互補(bǔ)粘性末端片斷之間的連接 ?（ 2）平（齊）末端片斷之間的連接 （ 1）具有互補(bǔ)粘性末端片斷之間的連接 ?該連接 可用 DNA ligase，也可用 T4 DNA連接酶 。 ?如果待連接的 DNA片斷的末端是用同一限制酶酶切所得，則連接后仍保留原限制酶的識(shí)別序列，如果是用兩種限制酶酶切所得，則重組DNA分子往往會(huì)失去原限制酶的識(shí)別序列， （ 1）具有互補(bǔ)粘性末端片斷之間的連接 ? 具粘性末端的載體易發(fā)生自連（防止方法）： ? 對(duì)載體的 5’末端進(jìn)行處理，用細(xì)菌的或小牛腸的 堿性磷酸酶移去磷酸基團(tuán)，使載體不能自連 。 ? 而外源片斷的 5’P能與載體的 3’OH進(jìn)行共價(jià)鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個(gè)連接位點(diǎn)中載體 DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去 5’P的鏈不能進(jìn)行連接， 形成3’ OH 和 5’ OH 的缺口 。但這樣的 DNA分子仍可以導(dǎo)入細(xì)菌細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞內(nèi)完成缺口的修復(fù)工作。 堿性磷酸酯酶 堿性磷酸酯酶： 是催化從單鏈或雙鏈 DNA和 RNA分子中除去 5′ 磷酸基，即脫磷酸作用。 在基因工程中得到廣泛使用的有兩種： ?一種是 BAP： 從大腸桿菌中提取的 ?另一種是 CIP： 從牛小腸提取的。 兩種酶反應(yīng)均需要 Zn2+。由于 BAP耐熱，而 CIP在70℃ 加熱 10分鐘或經(jīng)酚抽提則失活； CIP的特異活性較 BAP高 1020倍，因此， CIP應(yīng)用更廣泛。 ?主要用途： 去除 DNA和 RNA的 5′ 磷酸基，產(chǎn)生 5′ 羥基末端，然后在 T4多聚核苷酸激酶催化下，用 [α 32P]ATP進(jìn)行末端標(biāo)記，繼而進(jìn)行序列分析； 去除載體 DNA兩末端的 5′ 磷酸基，防止載體DNA自我環(huán)化，提高 DNA重組率。 （ 2）平（齊）末端片斷之間的連接 ?只能用 T4 DNA連接酶 ?如果用兩種不同的限制酶酶切所產(chǎn)生的平末端進(jìn)行連接，則連接后的 DNA分子會(huì)失去原來那兩種酶的識(shí)別序列； ?如兩片斷的末端是用同一限制酶酶切產(chǎn)生，則連接后的 DNA分子仍保留原限制酶的識(shí)別序列，有的還會(huì)出現(xiàn)新的限制酶的識(shí)別序列。 （ 2）平（齊）末端片斷之間的連接 ?連接平末端 DNA的方法除直接利用 T4 DNA ligase外，還可以用 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 給平末端加上同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶連接。 ? 常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法 末端轉(zhuǎn)移酶 ?催化脫氧核苷酸添加到 DNA分子的 3′ OH末端上 ?催化作用不要求有模板，但需有 Co2+的存在。 ?末端轉(zhuǎn)移酶可給一些 DNA分子的 3′ OH末端接上寡 dA或 dG；另一些 DNA分子的 3′ OH末端接上寡 dT或 dC，混合這些分子，即可使同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。 ?主要用途： 末端 （脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶 (TdT) 用途 ① 探針標(biāo)記 G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進(jìn)行連接 3180。 3180。 同聚物加尾法 ?該法的核心部分是利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移核苷酸的特殊功能，即 將核苷酸加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3’OH基團(tuán)上 ，即不需模板鏈進(jìn)行核苷酸的連接。 ?同聚物尾巴有 poly（ dA）與 poly（ dT）、 poly（ dC）與 poly（ dG）。 同聚物加尾法 用 5’ 末端特異的核酸外切酶處理 DNA片斷 在 A和 B分別中加入 dATP和 dTTP 同聚物尾巴 10~40個(gè)堿基 銜接物連接法 ? 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（ linker）進(jìn)行處理，人工加上粘性末端。 銜接物 是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個(gè)核苷酸，其 結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu) 。 ? 將銜接物分子與平末端 DNA分子連接，再用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，便可產(chǎn)生粘性末端。 ? 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。 雙銜接物連接法的基本程序 cDNA鏈的合成 通過 DNA聚合酶合成第二鏈 加入 Sal I銜接物 S I核酸酶作用后的末端單鏈突出序列， 由 Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物 Ecol I 雙銜接物 ：可以實(shí)現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時(shí)對(duì)克隆片斷的再刪除也比較方便。 DNA接頭（ adapter）連接法 ?DNA接頭（ adapter）：它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷 。 ?粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì) DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端 5’P，暴露出 5’OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。 ? 熱穩(wěn)定的 DNA連接酶從嗜熱高溫放線菌的菌株中分離出來的，能在高溫（ 85~94℃ ）下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。 ? （ 1）寡核苷酸連接測(cè)定（ OLA）
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