【文章內容簡介】 O5’3’5’3’POOOO3’5’5’3’5’3’5’3’5’3’5’3’A TP A D PD N A連接酶缺口 nick和裂口 gap ? 缺口 nick：即在雙鏈 DNA的某一條鏈上兩個相鄰的核苷酸之間失去一個 磷酸二酯鍵 所出現(xiàn)的單鏈斷裂，該斷裂 能為 DNA ligase所連接 。 ? 裂口 gap：即在雙鏈 DNA的某一條鏈上 失去一個或數(shù)個核苷酸 所形成的單鏈斷裂，該斷裂 不能為 DNA ligase所連接 。 常用 DNA ligase 來源 ? 由大腸桿菌染色體編碼的叫 DNA連接酶 ，即 DNA ligase， 以 NAD+為輔因子 由大腸桿菌 T4噬菌體編碼的叫T4 DNA連接酶，以 ATP為輔因子 ?基因工程中常用的連接酶主要有 ： T4DNA連接酶和大腸桿菌連接酶 ，而以前者為最常用。 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 5180。 5180。 (1) (2) AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 (a)分子間連接 (b)分子內連接 (1) (2) AT G C T A TA G C T A T4連接酶 T4連接酶 影響連接酶作用的因素 ?① 反應溫度： 連接缺口的溫度： 37度；連接粘性末端的最佳溫度： 4～ 15度 ?② Ｔ 4 DNA連接酶 的用量： ? 平末端 DNA分子的連接反應中，最適 1～ 2個單位。 ? 粘性末端 DNA片斷之間的連接，酶濃度 。 ? ATP的用量 10μmol~1mmol/L之間 ?③提高外源片斷與載體的濃度的比值，（ 10～ 20倍） 3. DNA片斷之間的連接 ?（ 1）具有互補粘性末端片斷之間的連接 ?（ 2）平（齊）末端片斷之間的連接 （ 1）具有互補粘性末端片斷之間的連接 ?該連接 可用 DNA ligase，也可用 T4 DNA連接酶 。 ?如果待連接的 DNA片斷的末端是用同一限制酶酶切所得，則連接后仍保留原限制酶的識別序列，如果是用兩種限制酶酶切所得，則重組DNA分子往往會失去原限制酶的識別序列， （ 1）具有互補粘性末端片斷之間的連接 ? 具粘性末端的載體易發(fā)生自連（防止方法）： ? 對載體的 5’末端進行處理，用細菌的或小牛腸的 堿性磷酸酶移去磷酸基團，使載體不能自連 。 ? 而外源片斷的 5’P能與載體的 3’OH進行共價鍵的連接。這樣形成的雜種分子中，每一個連接位點中載體 DNA只有一條鏈與外源片斷相連，失去 5’P的鏈不能進行連接， 形成3’ OH 和 5’ OH 的缺口 。但這樣的 DNA分子仍可以導入細菌細胞，并在宿主細胞內完成缺口的修復工作。 堿性磷酸酯酶 堿性磷酸酯酶： 是催化從單鏈或雙鏈 DNA和 RNA分子中除去 5′ 磷酸基，即脫磷酸作用。 在基因工程中得到廣泛使用的有兩種： ?一種是 BAP： 從大腸桿菌中提取的 ?另一種是 CIP： 從牛小腸提取的。 兩種酶反應均需要 Zn2+。由于 BAP耐熱，而 CIP在70℃ 加熱 10分鐘或經酚抽提則失活； CIP的特異活性較 BAP高 1020倍，因此， CIP應用更廣泛。 ?主要用途： 去除 DNA和 RNA的 5′ 磷酸基，產生 5′ 羥基末端，然后在 T4多聚核苷酸激酶催化下，用 [α 32P]ATP進行末端標記，繼而進行序列分析； 去除載體 DNA兩末端的 5′ 磷酸基，防止載體DNA自我環(huán)化，提高 DNA重組率。 （ 2）平（齊）末端片斷之間的連接 ?只能用 T4 DNA連接酶 ?如果用兩種不同的限制酶酶切所產生的平末端進行連接，則連接后的 DNA分子會失去原來那兩種酶的識別序列； ?如兩片斷的末端是用同一限制酶酶切產生，則連接后的 DNA分子仍保留原限制酶的識別序列，有的還會出現(xiàn)新的限制酶的識別序列。 （ 2）平（齊）末端片斷之間的連接 ?連接平末端 DNA的方法除直接利用 T4 DNA ligase外，還可以用 末端核苷酸轉移酶 給平末端加上同聚物尾巴之后，再用 DNA連接酶連接。 ? 常用的連接方法：同聚物加尾法、銜接物法和接頭連接法 末端轉移酶 ?催化脫氧核苷酸添加到 DNA分子的 3′ OH末端上 ?催化作用不要求有模板，但需有 Co2+的存在。 ?末端轉移酶可給一些 DNA分子的 3′ OH末端接上寡 dA或 dG；另一些 DNA分子的 3′ OH末端接上寡 dT或 dC，混合這些分子，即可使同聚物尾部退火形成環(huán)狀分子。 ?主要用途： 末端 （脫氧核苷酸）轉移酶 (TdT) 用途 ① 探針標記 G32G32G32G32 G32G32G32G32 ② 在載體和待克隆的片段上形成同聚物尾 ， 以便于進行連接 3180。 3180。 同聚物加尾法 ?該法的核心部分是利用末端脫氧核苷酸轉移酶轉移核苷酸的特殊功能，即 將核苷酸加到 DNA分子單鏈延伸末端的 3’OH基團上 ，即不需模板鏈進行核苷酸的連接。 ?同聚物尾巴有 poly（ dA）與 poly（ dT）、 poly（ dC）與 poly（ dG）。 同聚物加尾法 用 5’ 末端特異的核酸外切酶處理 DNA片斷 在 A和 B分別中加入 dATP和 dTTP 同聚物尾巴 10~40個堿基 銜接物連接法 ? 平末端的另一種處理方式是利用銜接物（ linker）進行處理，人工加上粘性末端。 銜接物 是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個核苷酸，其 結構特征是含有多種限制性核酸內切酶的酶切位點的回文結構 。 ? 將銜接物分子與平末端 DNA分子連接，再用限制性核酸內切酶酶切，便可產生粘性末端。 ? 這種方法的優(yōu)點是克隆位點具有限制酶的酶切位點。 雙銜接物連接法的基本程序 cDNA鏈的合成 通過 DNA聚合酶合成第二鏈 加入 Sal I銜接物 S I核酸酶作用后的末端單鏈突出序列， 由 Klenow補齊，加入第二銜接物 Ecol I 雙銜接物 ：可以實現(xiàn)定向克隆，防止發(fā)生自連，同時對克隆片斷的再刪除也比較方便。 DNA接頭（ adapter）連接法 ?DNA接頭（ adapter）：它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端，另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷 。 ?粘性末端容易通過堿基配對形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對 DNA接頭分子末端，進行必要的修飾。移走粘性末端 5’P，暴露出 5’OH，不能產生穩(wěn)定的二聚體分子。 ? 熱穩(wěn)定的 DNA連接酶從嗜熱高溫放線菌的菌株中分離出來的，能在高溫（ 85~94℃ ）下催化兩條寡核苷酸探針發(fā)生連接用的一種核酸酶。 ? （ 1）寡核苷酸連接測定（ OLA）