細菌遺傳學與基因工程(編輯修改稿)
2024-10-08 21:38 本頁面
【文章內容簡介】 一種限制性核酸內切酶只能識別 一種特定 的脫氧核苷酸序列 B. 限制性核酸內切酶的活性 受溫度影響 C. 限制性核酸內切酶能 識別和切割 RNA D. 限制性核酸內切酶可以 從原核生物中提取 6． DNA連接酶 ——“ 分子縫合針 ” ? 作用： 恢復被限制酶切開了的兩個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵。 ? 種類 ⑴ DNA連接酶： 只能縫合雙鏈 DNA片段互補的 黏性末端 ，而不能將雙鏈 DNA平末端進行連接。 ⑵ T4 DNA連接酶： 既可縫合 DNA片段互補的 黏性末端 ，又可縫合雙鏈 DNA片段的 平末端 。但連接平末端之間的效率比較低。 重組 DNA技術的主要技術原理 6． DNA連接酶 ——“ 分子縫合針 ” ? DNA連接酶和 DNA聚合酶的比較 : DNA連接酶 DNA聚合酶 連接 DNA鏈 雙鏈 單鏈 連接部位 在兩 DNA片段之間形成磷酸二酯鍵 將單個核苷酸加到已存在的核酸片段的 3’端的羥基上，形成磷酸二酯鍵 重組 DNA技術的主要技術原理 7． 基因的載體 ——“ 分子運輸車 ” ? 作用： 是基因運輸的工具 :一是用它作為運載工具，將目的基因送到宿主細胞中去；二是利用它在宿主細胞內對目的基因進行大量復制。 ? 條件 ①能在宿主細胞內穩(wěn)定保存并大量復制； ②有一個至多個限制酶切點，以便與外源基因連接； ③具有某些標記基因，以便進行篩選。 重組 DNA技術的主要技術原理 7． 基因的載體 ——“ 分子運輸車 ” 種類 ： ? 目前，基因工程經常使用的載體主要有以下幾類： ⑴ 細菌的質粒：最常用的載體。 ⑵ 噬菌體 ⑶動植物病毒 它們來源不同，在大小、結構、復制以及插入片段大小上也有很大差別 重組 DNA技術的主要技術原理 8．細菌的轉化 ? 一細菌菌株捕獲另一細菌菌株的 DNA，導致性狀特征發(fā)生遺傳改變 ? 供體菌株 –受體菌株 ? 大腸桿菌是最廣泛使用的實驗菌株 ? CaCl2處理大腸桿菌細胞，使之呈感受態(tài)（ Competent Cells） ? 每 μ g DNA可得 107108個轉化子 重組 DNA技術的主要技術原理 小結 限制性內切酶 ：來源、功能、作用特點 第二節(jié)重組 DNA技術的基本操作程序 （一）第一步 ——目的基因的獲取 ? 1. 目的基因 ? 2. 獲取目的基因的方法 ? （ 1）從基因文庫中獲取目的基因 ? ①基因文庫 ：將含有某種生物不同基因的許多 DNA片段 ，導入受體菌的群體中 儲存 ，各個受體菌分別含有這種生物的不同基因，稱為基因文庫。 ? ②目的基因的獲取 ? 根據基因的有關信息：基因的 脫氧核苷酸 序列、基因在 染色體 上的位置、基因的 轉錄 產物 mRNA、基因的 翻譯 產物蛋白質等特性獲取目的基因。 ? 優(yōu)點：有了基因文庫，就可隨時從中提取所需要的目的基因，引入受體細胞使之表達。 第二節(jié)重組 DNA技術的基本操作程序 （一）第一步 ——目的基因的獲取 ? 1. 目的基因 ? 2. 獲取目的基因的方法 ? （ 2） 人工合成法： 如果基因比較小，核苷酸序列又已知，也可以通過 DNA合成儀用化學方法人工合成。 ? ①反轉錄法： 以目的基因轉錄成的信使 RNA為模板，反轉錄成互補的單鏈 DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈 DNA，從而獲得所需要的基因。 ? ②人工合成： 蛋白質的氨基酸序列 ? mRNA序列 ? 結構基因的核苷酸序列 ? 通過化學方法合成目的基因。 如人的血紅蛋白基因、胰島素基因。 ? （ 3）利用 PCR技術擴增目的基因。 第二節(jié)重組 DNA技術的基本操作程序 （二）第二步 基因表達載體的構建 ? 1. 目的： 使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 ? 2. 表達載體的組成： ? ①啟動子： ? ②終止子： ? ③標記基因： 基因表達載體模式圖 第二節(jié)重組 DNA技術的基本操作程序 （二）第二步 基因表達載體的構建 ? 構建步驟 ? ① 酶切質粒 ? ②用同種限制酶切割目的基因 ? ③適量的 DNA連接酶，結合成重組質粒。 第二節(jié)重組 DNA技術的基本操作程序 （三）將目的基因導入受體細胞 轉化： 方法：受體種類不同，導入的方法不同。 （ 1）導入植物細胞 Ⅰ 、農桿菌轉化法 Ⅱ 、基因槍法（又稱微彈轟擊法） Ⅲ 、花粉管通道法： （ 2）導入動物細胞 方法：顯微注射 技術。 （ 3）導入微生物細胞 第二節(jié)重組 DNA技術的基本操作程序 （三）將目的基因導入受體細胞 轉化實質：目的基因整合到受體細胞染色體基因組中。
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