細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程-資料下載頁(yè)
2025-09-11 21:38本頁(yè)面
【正文】 Em（紅霉素） Tn971 Em（紅霉素） Tn1681 大腸埃希菌（腸毒素基因） 第四節(jié) 文庫(kù)構(gòu)建與酵母雙雜 ? 分析基因 /蛋白互作的主要方法： （ 1） 構(gòu)建 cDNA、 DNA文庫(kù) ，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針?lè)蛛x新的目的基因； （ 2）差式 雜交 (differential screen)和扣除雜交 (subtractive hybridization)技術(shù)； （ 3） DDRTPCR法及 差別顯示 技術(shù)； （ 4） 差別分析法 (Representational difference analysis, RDA）； （ 5） 酵母雙雜交 Twohybrid system； （ 6） 圖位克隆法 （ mapbased cloning）與 染色體步移 （ genomic DNA Walking）。 基因組文庫(kù)的構(gòu)建 ? genomic library ： 整個(gè)基因組 DNA切成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段，連接在載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中而構(gòu)建的克隆總體。 ? 應(yīng)用 ?噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫(kù)的程序： ①消化，約 20kb； ②切割載體； ③除去 ?噬菌體裂解生長(zhǎng)非必需的內(nèi)部片段； ④連接； ⑤體外包裝系統(tǒng)進(jìn)行噬菌體的組裝； ⑥重組噬菌體侵染 E. coli，每一克隆中含有外源 DNA的一種片段，全部克隆構(gòu)成一個(gè)基因文庫(kù)。 用HacⅢAlul雙酶消化法 采用核酸內(nèi)切限制酶Sau3A進(jìn)行局部消化 基因組文庫(kù)技術(shù)(引自Griffiths et a96) cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 ? cDNA文庫(kù) ： 以某生物的總 mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶成雙鏈 cDNA，連接到載體上，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后構(gòu)建的基因文庫(kù)。一般比基因組文庫(kù)小10100倍 ? 基本程序： ① mRNA的提取和純化。 ②合成 cDNA第一鏈。 ③將 mRNAcDNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈 cDNA分子。 ④將雙鏈 cDNA重組到噬菌體載體或質(zhì)粒載體上。 ⑤將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒導(dǎo)入到大腸桿菌寄主細(xì)胞中增殖。 cDNA文庫(kù)構(gòu)建(引自O(shè)ld amp。 Primrose,1980) 酵母雙雜交體系 ? Twohybrid system/interaction trap， 90年代初發(fā)展起來(lái) ? 基本原理： 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由 2個(gè)結(jié)構(gòu)上分開(kāi)、功能上獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。 如 GAL4的 N端 1147aa是 DNA結(jié)合域（ BD），其 C端 768881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（ AD）。一般情況下， AD能與 GAL4效應(yīng)基因啟動(dòng)子上游的特定 DNA區(qū)段（ UAS）相結(jié)合，而此時(shí)， AD則推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄起始。 若用基因工程的方法，將 GAL4 AD和 BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá)，效應(yīng)基因無(wú)法被激活 ,但可把來(lái)自不同轉(zhuǎn)錄因子的 AD或 BD區(qū)域連成一個(gè)功能基因。 總 RNA提取、純化 mRNA分離 高豐度 mRNA差異消減 cDNA制備 cDNA連接 AD載體 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 cDNA文庫(kù)效價(jià)測(cè)定 cDNA文庫(kù)擴(kuò)增等 酵母雙雜交體系 ? 主要實(shí)驗(yàn)過(guò)程： a. 選擇 缺失 GAL4編碼基因的酵母寄主 菌株 SFY526或 HF7c； b. 構(gòu)建帶有 GAL1 UAS啟動(dòng)子 lac Z（ His3）的 轉(zhuǎn)化載體 。 c. 把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到 pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到 pGAD424載體上，構(gòu)成 cDNA表達(dá)文庫(kù) 。 d. 從大腸桿菌中分別提取這 兩種重組質(zhì)粒 DNA， 共轉(zhuǎn)化 感受態(tài)釀酒酵母菌株。 e. 將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少 Leu， Trp和 His的培養(yǎng)基上， 篩選 表達(dá)相互作用的雜種蛋白的 陽(yáng)性菌落 。 酵母雙雜交文庫(kù)的利用 1） 比對(duì)病變組織 ,找到突變基因或者導(dǎo)致變異的蛋白 。 2） 大規(guī)模的蛋白篩選，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)找到某些藥物對(duì)相關(guān)組織主要的作用蛋白， 對(duì)于藥物的修飾和改進(jìn) 明確方向。 3） 可反復(fù)使用，培養(yǎng)時(shí)間短，適合 大規(guī)模篩選使用 。 4） 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的， 省去純化蛋白質(zhì) 的繁瑣步驟。 5） 檢測(cè)在活細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行， 可以在一定程度上代表細(xì)胞內(nèi)的真實(shí)情況。檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可 檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用 。 舉例 …… 謝謝！
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