細菌遺傳學與基因工程-資料下載頁
2025-09-11 21:38本頁面
【正文】 Em（紅霉素） Tn971 Em（紅霉素） Tn1681 大腸埃希菌（腸毒素基因） 第四節(jié) 文庫構(gòu)建與酵母雙雜 ? 分析基因 /蛋白互作的主要方法： （ 1） 構(gòu)建 cDNA、 DNA文庫 ，應(yīng)用現(xiàn)有核酸探針分離新的目的基因； （ 2）差式 雜交 (differential screen)和扣除雜交 (subtractive hybridization)技術(shù)； （ 3） DDRTPCR法及 差別顯示 技術(shù)； （ 4） 差別分析法 (Representational difference analysis, RDA）； （ 5） 酵母雙雜交 Twohybrid system； （ 6） 圖位克隆法 （ mapbased cloning）與 染色體步移 （ genomic DNA Walking）。 基因組文庫的構(gòu)建 ? genomic library ： 整個基因組 DNA切成適當長度的片段，連接在載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細胞中而構(gòu)建的克隆總體。 ? 應(yīng)用 ?噬菌體載體構(gòu)建基因組文庫的程序： ①消化，約 20kb； ②切割載體； ③除去 ?噬菌體裂解生長非必需的內(nèi)部片段； ④連接； ⑤體外包裝系統(tǒng)進行噬菌體的組裝； ⑥重組噬菌體侵染 E. coli，每一克隆中含有外源 DNA的一種片段，全部克隆構(gòu)成一個基因文庫。 用HacⅢAlul雙酶消化法 采用核酸內(nèi)切限制酶Sau3A進行局部消化 基因組文庫技術(shù)(引自Griffiths et a96) cDNA文庫的構(gòu)建 ? cDNA文庫 ： 以某生物的總 mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶成雙鏈 cDNA，連接到載體上，轉(zhuǎn)化宿主細胞后構(gòu)建的基因文庫。一般比基因組文庫小10100倍 ? 基本程序： ① mRNA的提取和純化。 ②合成 cDNA第一鏈。 ③將 mRNAcDNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈 cDNA分子。 ④將雙鏈 cDNA重組到噬菌體載體或質(zhì)粒載體上。 ⑤將重組子體外包裝成具有感染力的噬菌體顆粒導入到大腸桿菌寄主細胞中增殖。 cDNA文庫構(gòu)建(引自O(shè)ld amp。 Primrose,1980) 酵母雙雜交體系 ? Twohybrid system/interaction trap， 90年代初發(fā)展起來 ? 基本原理： 真核生物的轉(zhuǎn)錄因子大多是由 2個結(jié)構(gòu)上分開、功能上獨立的結(jié)構(gòu)域組成的。 如 GAL4的 N端 1147aa是 DNA結(jié)合域（ BD），其 C端 768881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（ AD）。一般情況下， AD能與 GAL4效應(yīng)基因啟動子上游的特定 DNA區(qū)段（ UAS）相結(jié)合，而此時， AD則推動了轉(zhuǎn)錄起始。 若用基因工程的方法，將 GAL4 AD和 BD分別克隆到不同的載體上，導入同一細胞株中表達，效應(yīng)基因無法被激活 ,但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的 AD或 BD區(qū)域連成一個功能基因。 總 RNA提取、純化 mRNA分離 高豐度 mRNA差異消減 cDNA制備 cDNA連接 AD載體 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌 cDNA文庫效價測定 cDNA文庫擴增等 酵母雙雜交體系 ? 主要實驗過程： a. 選擇 缺失 GAL4編碼基因的酵母寄主 菌株 SFY526或 HF7c； b. 構(gòu)建帶有 GAL1 UAS啟動子 lac Z（ His3）的 轉(zhuǎn)化載體 。 c. 把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到 pGBT9的多克隆位點上，把所有cDNA都克隆到 pGAD424載體上，構(gòu)成 cDNA表達文庫 。 d. 從大腸桿菌中分別提取這 兩種重組質(zhì)粒 DNA， 共轉(zhuǎn)化 感受態(tài)釀酒酵母菌株。 e. 將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少 Leu， Trp和 His的培養(yǎng)基上， 篩選 表達相互作用的雜種蛋白的 陽性菌落 。 酵母雙雜交文庫的利用 1） 比對病變組織 ,找到突變基因或者導致變異的蛋白 。 2） 大規(guī)模的蛋白篩選，在較短時間內(nèi)對找到某些藥物對相關(guān)組織主要的作用蛋白， 對于藥物的修飾和改進 明確方向。 3） 可反復(fù)使用，培養(yǎng)時間短，適合 大規(guī)模篩選使用 。 4） 作用信號是在融合基因表達后， 在細胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的， 省去純化蛋白質(zhì) 的繁瑣步驟。 5） 檢測在活細胞內(nèi)進行， 可以在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。檢測的結(jié)果可以是基因表達產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可 檢測存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時的相互作用 。 舉例 …… 謝謝！
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