基因工程育種微生物遺傳育種-資料下載頁
2025-01-09 13:22本頁面
【正文】 ? DNA聚合酶 ? dNTPs ? ddNTP 54 測序反應(yīng) 制備聚丙烯酰胺凝膠 凝膠加樣 電泳 結(jié)果記錄與分析 55 56 57 六、外源基因的表達(dá) 影響表達(dá)的因素 ? 細(xì)胞中基因拷貝數(shù)：拷貝數(shù)多，產(chǎn)物多 ? 轉(zhuǎn)錄水平：啟動子與 RNA多聚酶的統(tǒng)一 ? 翻譯水平： mRNA的核糖體結(jié)合部位與宿主核糖體的統(tǒng)一；密碼子與 tRNA的統(tǒng)一； mRNA的穩(wěn)定性 ? 外源基因的插入方向 ? 轉(zhuǎn)錄后的修飾及翻譯后的修飾 58 第四節(jié) 基因工程的實(shí)際應(yīng)用 ? 微生物發(fā)酵 ? 病毒疫苗 ? 哺乳動物蛋白（人源蛋白藥物） ? 轉(zhuǎn)基因動植物 ? 環(huán)境生物技術(shù) ? 基因診斷與基因治療 ? 蛋白質(zhì)工程（定點(diǎn)突變、定向進(jìn)化） ? 代謝工程 59 復(fù)習(xí)題 何謂基因工程？基因工程操作主要步驟。 何謂限制性核酸內(nèi)切酶？ Ⅱ 型限制性核 酸內(nèi)切酶有何特點(diǎn)？ 克隆載體的基本要求。 質(zhì)粒的表型效應(yīng)、分類、命名。 目的基因的獲得途徑 名詞：基因文庫、 cDNA文庫、 PCR、 質(zhì)粒不親和性 60 插入鈍化 /失活（ insertional inactivation) 由于外源 DNA插入到某一基因內(nèi)而使其功能喪失的現(xiàn)象。 ?受體細(xì)胞是 Amp、 Tet的敏感型 ?在 Amp+Tet培養(yǎng)基上生長的是野生型質(zhì)粒 ?只在 Amp培養(yǎng)基上生長的帶有重組質(zhì)粒 選擇性標(biāo)記篩選 61 b半乳糖苷酶顯色反應(yīng)（藍(lán)白斑篩選） ? β半乳糖苷酶能將無色底物 Xgal切割成半乳糖和深藍(lán)色的 5bromo4chloroindigo，菌落呈 藍(lán)色 ? 宿主基因合成的是缺失 N末端 11~41氨基酸的缺陷型酶，無活性 ? pUC系列等質(zhì)粒具有 lacZ’基因，所編碼酶的 N末端片段與宿主基因產(chǎn)物組成有活性的酶（ α互補(bǔ)），菌落呈 藍(lán)色 ? pUC質(zhì)粒上在 lacZ’中間具有 MCS，外源 DNA片段的插入，使 lacZ’無完整產(chǎn)物，不能與宿主產(chǎn)物組成有活性的酶，菌落呈無色 62 轉(zhuǎn)化子電泳分析 63 64 常用宿主系統(tǒng) ? 受體細(xì)胞應(yīng)具備的條件 ? 限制性缺陷型 RecB， RecC， hsdR； ? 重組整合缺陷型 RecA（對于用于基因擴(kuò)增或基因高效表達(dá)的受體）； ? 具有較高的轉(zhuǎn)化效率 ? 具有與重組體互補(bǔ)的遺傳性狀 ? 無毒，無致病性，感染與寄生缺陷型 （安全角度的要求） ? 生長迅速，容易培養(yǎng) ? 遺傳背景清楚，遺傳性狀穩(wěn)定 65 ? 各種生物受體細(xì)胞的特性 ? 大腸桿菌：繁殖迅速，載體系統(tǒng)完備，遺傳背景清楚；產(chǎn)內(nèi)毒素，潛在致病性，蛋白質(zhì)分泌難 ? 枯草桿菌：無潛在致病性，不產(chǎn)內(nèi)毒素，蛋白質(zhì)分泌 ；遺傳不穩(wěn)定性，高蛋白酶活性 ? 鏈霉菌：原核生物基因的克隆表達(dá)及蛋白產(chǎn)物的分泌 ? 釀酒酵母：繁殖迅速，遺傳背景清楚，真核性；蛋白質(zhì)產(chǎn)物含量太高，基因表達(dá)產(chǎn)物難于分離純化，適用于真核生物基因的表達(dá) 66 ? 各種生物受體細(xì)胞的特性 ? 畢赤酵母：繁殖迅速，可以高密度培養(yǎng)，甲醇營養(yǎng)型，真核性，本身蛋白質(zhì)產(chǎn)物分泌少；翻譯后過度修飾 （ ？） ? 高等動物細(xì)胞：分子重組表達(dá)系統(tǒng)健全，真核性；細(xì)胞培養(yǎng)要求苛刻，生長緩慢。適用于人源基因產(chǎn)物的表達(dá) ? 高等植物細(xì)胞：農(nóng)作物的經(jīng)濟(jì)意義重大，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞易于分化，細(xì)胞培養(yǎng)簡單；遺傳操作困難繁瑣。適用于植物基因的表達(dá)及植物品種的改良
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