【正文】 胞。使用最廣泛的是。 其次為枯草桿菌和釀酒酵母。 ? 以重組質(zhì)粒作載體 ,用轉(zhuǎn)化方法； 以病毒DNA作重組載體 ,用感染方法。 ? 理想情況，重組載體進(jìn)入受體細(xì)胞 ,通過自主復(fù)制而大量擴(kuò)增 ,使受體細(xì)胞表達(dá)出供體基因所提供的部分遺傳性狀 ,受體細(xì)胞就成為“工程菌”。 基因工程的主要操作步驟 二、基因工程在微生物方面的應(yīng)用 ? 提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量：例如所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系統(tǒng)中克隆與表達(dá)。其中蘇氨酸、色氨酸、脯氨酸和組氨酸等工程菌已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平。蘇氨酸工程菌在前蘇聯(lián)和日本都已用于工業(yè)生產(chǎn) ,蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 60g/L以上，我國蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 20g/L 。 二、基因工程在微生物方面的應(yīng)用 ? 生產(chǎn)新的抗菌素 天藍(lán)鏈霉菌合成藍(lán)色的多酮肽抗菌素－放線紫紅素，麥迪霉素產(chǎn)生菌合成褐色的麥迪霉素。經(jīng)過兩級克隆，麥迪霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生一種新的紫色化合物，是麥迪霉素與放線紫紅素的雜種化合物，為一種新的抗菌素 ,命名為 MederhodinA。 二、基因工程在微生物方面的應(yīng)用 ? 改良工業(yè)酶生產(chǎn)菌株 ： 蛋白酶、木糖異構(gòu)酶、纖維素酶、葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均進(jìn)行了研究。研究較多的是 α淀粉酶和青霉素?；浮? ? 1981年起 ， 在枯草桿菌或大腸桿菌中克隆和表達(dá)了來自枯草桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等菌種的 α－ 淀粉酶基因 ，比野生株 最高的可達(dá) 30倍。目前美國已用基因工程菌生產(chǎn)。 ? 德國首先克隆大腸桿菌青霉素 G?；富颉Ｎ覈嗝顾?G?；傅漠a(chǎn)量可達(dá) 3000單位 /L以上。 第五節(jié) 菌種保藏 ? 微生物受外界環(huán)境的影響會經(jīng)常地發(fā)生小機(jī)率的變異，這種變異可能造成菌種生產(chǎn)性狀的劣化或自身死亡。 ? 要使菌種在生產(chǎn)中長期保持優(yōu)良的生產(chǎn)性狀就必須設(shè)法減少菌種的退化和死亡，做好保藏工作。 一、菌種退化及其防治 ? （一）、菌種退化：生產(chǎn)菌株生產(chǎn)性狀的劣化或遺傳研究菌株遺傳標(biāo)記的丟失。如產(chǎn)孢能力喪失、發(fā)酵液產(chǎn)物組成改變、主產(chǎn)物減少和副產(chǎn)物增加等。 ? 菌種退化是一個逐漸發(fā)展的過程，指細(xì)胞群體的變化，而不是指單個細(xì)胞的變化。自發(fā)變異的單個細(xì)胞與其它細(xì)胞一起接入新鮮培養(yǎng)基時，由于細(xì)胞生理、代謝調(diào)節(jié)及產(chǎn)生產(chǎn)物的不同，在某些培養(yǎng)條件下，發(fā)生自發(fā)變異退化細(xì)胞的數(shù)量可能逐漸增多，經(jīng)過多次傳代能使此變異類型完全占優(yōu)勢而導(dǎo)致細(xì)胞群體的退化。 一、菌種退化及其防治 ? 環(huán)境條件可以影響菌種退化的速率。不利環(huán)境往往加速突變型生產(chǎn)菌向野生型方向退化。單純環(huán)境條件如碳源、氮源、 pH、 溫度等造成生產(chǎn)性狀的下降是因批而異的，下一次發(fā)酵可以完全恢復(fù)正常，菌種本身并沒有變化，不是退化。由于雜菌污染導(dǎo)致生產(chǎn)性狀下降也不是退化，通過采取對設(shè)備的清洗、維修、重新殺菌等一系列措施，加強(qiáng)無菌操作，可以避免雜菌的繼續(xù)污染。只有菌株本身性狀的劣化，才是退化。 一、菌種退化及其防治 ? （二）、菌種退化的原因： ? 基因（負(fù)）突變。缺陷型基因發(fā)生頻率很低的回復(fù)突變，由于具有生長優(yōu)勢，在傳代過程中，數(shù)量比例上升很快，就斜面菌種而言退化細(xì)胞還只是少數(shù)，但發(fā)酵過程中這些少數(shù)菌的存在會使退化性狀表現(xiàn)強(qiáng)烈，成為事實上退化菌種。 一、菌種退化及其防治 ? 非基因突變 。如構(gòu)窠曲霉用分生孢子傳代，子囊孢子逐漸減少，表現(xiàn)出不產(chǎn)子囊孢子的“突變”；如果用子囊孢子傳代，則分生孢子逐漸減少。培養(yǎng)和保藏條件可以從多方面影響菌種的退化。如陳舊的培養(yǎng)物中可能積累對微生物有毒害作用的物質(zhì)而提高突變率，溫度上升也有利于突變，某些營養(yǎng)成分的不足可促進(jìn)野生型回復(fù)突變株的生長優(yōu)勢。泡盛曲霉變異菌株糖化酶產(chǎn)生株在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上傳代酶產(chǎn)量降低極少，在麥汁酵母膏培養(yǎng)基上傳到第 10代，產(chǎn)酶能力降至 1/4。 一、菌種退化及其防治 ? （三）、菌種退化的防治： ? 菌種選育方法 使用單核細(xì)胞；采用較高劑量使單鏈突變而使另一單鏈喪失作為模板的能力，減少分離回復(fù)。誘變處理后進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純粹，不再發(fā)生分離回復(fù)。 ? 菌種保藏方式 溫度影響自發(fā)突變及細(xì)胞活力。斜面保藏于 4℃ 時，突變的可能性大，且斜面保藏一般每 3個月到半年需傳代 1次，對菌種不利。作為生產(chǎn)菌株需同時采用斜面保藏和其它的保藏方式如冷凍干燥孢子、砂土管及液氮保存等。保藏所用的斜面培養(yǎng)基組成應(yīng)根據(jù)不同菌種的特性加以選擇。 一、菌種退化及其防治 ? 菌種培養(yǎng)條件 ①給予營養(yǎng) 缺陷型菌適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)必需成分降低回復(fù)突變頻率；②給予抗性菌以一定濃度的藥物，使回復(fù)的敏感型菌株的生長受到抑制，而生產(chǎn)菌能正常生長；③控制培養(yǎng)基中氮源或碳源的性質(zhì)，使之有利于生產(chǎn)菌株而不利于退化菌株的生長，從而限制退化菌株的數(shù)量上升；④改變培養(yǎng) pH、 溫度等條件防止退化。如棲土曲霉 ，培養(yǎng)溫度由 28～ 30℃提高到 30 ～ 34℃ 防止了產(chǎn)孢子能力的衰退。避免使用陳舊的培養(yǎng)物作為種子。 一、菌種退化及其防治 ? 菌種管理措施 定期針對性地進(jìn)行分離純化。純化可以用劃線分離、稀釋分離、單孢子分離等方法，所得單菌落需作生產(chǎn)性狀測試，以保證性能優(yōu)良。利用生產(chǎn)菌株的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型及抗性等，進(jìn)行生長譜平板檢查、藥物濃縮或抗性平板生長等也是純化的方法。使已部分退化的菌種接觸一些惡劣環(huán)境，如藥物、低溫及高溫等，汰弱留強(qiáng)。絲狀菌采用孢子移種避免菌絲傳代，交替使用分生孢子和子囊孢子傳代等也可防止退化。 二、菌種復(fù)壯 ? （一）、純種分離：從退化菌種的細(xì)胞群體中分離出保持原有典型性狀的單細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，恢復(fù)原菌株的典型性狀。稀釋、單細(xì)胞分離等。 ? （二）、通過寄主體進(jìn)行復(fù)壯：寄生性退化菌株，回接到相應(yīng)寄主體上，以恢復(fù)或提高其寄生性能。 ? （三）、淘汰衰退個體：例如對 “ 5406” 放線菌的分生孢子 ， 采用 10～ 30℃ 5～ 7天 ， 死亡率達(dá)80%， 在抗低溫的存活個體中 ， 留下了未退化的健壯個體。 三、菌種保藏 ? （一）、菌種保藏原理：選擇典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體 (如分生孢子、芽孢等 )；創(chuàng)造有利休眠的環(huán)境條件，如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等。保持原種的優(yōu)良性狀不變，同時考慮方法的通用性和簡便性。 三、菌種保藏 ? （二）、菌種保藏的方法： ? 斜面菌種低溫保藏法 把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等，直接放入 4～ 5℃ 冰箱中。保藏時間一般不超過 3個月，到時必須進(jìn)行移接傳代，再放回冰箱。 ? 砂土管保藏法 將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏 。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。此法適用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。保藏期 1～ 10年。 三、菌種保藏 ? 石蠟油封藏法 向培養(yǎng)好的菌種斜面上加入滅菌石蠟油，高出斜面 1cm， 然后蠟封管口，立放在冰箱中。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。保藏期 1～ 2年 。 ? 真空冷凍干燥法 在低于 15℃ 下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華致干。使生長代謝暫時停止，不易發(fā)生變異，可長時間保存，一般為 5～ 10年，最多可達(dá) 15年。 三、菌種保藏 ? （二）、國內(nèi)外菌種保藏部分情況： ? 我國 1979年 7月成立中國微生物菌種保藏管理委員會 (CCCCM) ， 亞洲第一，有 14000余株各種微生物，三種保藏方法（斜面．凍干．液氮）下設(shè) 5個菌種保藏管理中心。 ? 普通微生物菌種保藏管理中心 (CCGMC)中科院微生物所，北京 (AS)， 真菌、細(xì)菌；中科院武漢病毒研究所，武漢 (ASIV)， 病毒。 三、菌種保藏 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (ACCC) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京 (ISF)。 ? 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (CICC) 輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所，南京 (ID)，真菌；衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京(NICPBP)， 細(xì)菌；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所，北京 (IV)， 病毒。 三、菌種保藏 抗菌素菌種保藏管理中心 (CACC)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所，北京 (IA)； 四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 (SIA)， 新抗菌素菌種；華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊 (IANP)， 生產(chǎn)用抗菌素菌種。 ? 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 (CVCC) 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 (CIVBP) 。 ? 除了上述保藏中心外 ， 從事微生物研究并保藏有一定數(shù)量各類專業(yè)用微生物菌種的科研單位、大專院校還有近百所。 三、菌種保藏 ? 美國“美國典型菌種收藏所” (ATCC)。 ? 美國“農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部菌種收藏所” (ARS)設(shè)立“北方地區(qū)研究室” (NRRL)。 ? 荷蘭“真菌中心收藏所” (CBS)。 ? 日本“大阪發(fā)酵研究所” (IFO)。 ? 法國“里昂巴斯德研究所” (IPL)。 ? 西德“柯赫研究所” (RKI)。 ? 蘇聯(lián)“蘇聯(lián)科學(xué)院微生物研究所” (IM)。 三、菌種保藏 ? ATCC僅采用兩種最有效的方法，即保藏期 5～ 15年的冷凍干燥保藏法和 20年以上的液氮保藏法，以最大限度地減少傳代次數(shù)和避免菌種衰退。 ? 保藏措施 :當(dāng)菌種保藏單位收到合適菌種時，先將原種制成若干液氮保藏管作為保藏菌種；然后再制一批冷凍干燥保藏菌種作為分發(fā)用。經(jīng) 5年后，假定第1代 (原種 )的冷凍干燥保藏菌種已分發(fā)完畢，就再打開一瓶液氮保藏原種。至少在 20年內(nèi)，凡獲得該菌種的用戶，至多只是原種的第 2代，可以保證所保藏和分發(fā)菌種的原有性狀。 三、菌種的保藏 ? 根據(jù)世界菌種保藏聯(lián)合會調(diào)查 ， 55個國家的菌種保藏機(jī)構(gòu)共有 352個 ，許多大學(xué)及研究所都有自己的保藏機(jī)構(gòu)。 復(fù)習(xí)思考題 ? 證明核酸是遺傳變異物質(zhì)基礎(chǔ)的經(jīng)典實驗有幾個 ?請詳細(xì)說明實驗的過程。 ? 3個著名實驗者選用了微生物作為研究對象 ? ? 存在方式。 ? ?它有哪些特點 ? ? ?基因突變可分哪幾類 ? 復(fù)習(xí)思考題 ? ，說明突變的分子機(jī)制。 ? 因重組形式 ? ? F＋ 、 F－ 、 Hfr和 F′菌株的異同，并圖示它們的相互關(guān)系。 ? ，有哪些環(huán)節(jié) ? ? ? 復(fù)習(xí)思考題 ? ? ? ?它的基本操作步驟是什么 ? ? ?菌種退化的原因有哪些 ? ? 哪些 ? ? ? 謝謝觀看 /歡迎下載 BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH