【正文】 癌物的符合率＞ 85%）和費(fèi)用省等優(yōu)點(diǎn)。 ? 選擇誘變劑的種類 ：在選用理化因子作誘變劑時(shí)，在同樣效果下，應(yīng)選用 最方便 的因素；而在同樣方便的情況下，則應(yīng)選擇 最高效 的因素。在物理誘變劑中，尤以 紫外線 為最方便，而在化學(xué)誘變劑中，一般可選用誘變效果最為顯著的“超誘變劑”，如 NTG(N甲基N’硝基 N亞硝基胍 )。 ? 采用簡(jiǎn)便有效的誘變方法： 紫外線的照射最為方便。 化學(xué)誘變劑的種類、濃度和處理方法尤其是中止反應(yīng)的方法很多，實(shí)際工作時(shí)可參看有關(guān)書籍。一種較有效的簡(jiǎn)易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞，然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒（也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片），經(jīng)培養(yǎng)后，在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落，分別制成懸浮液，然后將其涂在一般平板表面使長(zhǎng)出許多單菌落，最后可用影印培養(yǎng)法或逐個(gè)檢出法選出突變種。 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng)（ synergism） ? 誘變劑的復(fù)合處理常常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)，這對(duì)育種工作是很有參考價(jià)值的。復(fù)合處理有幾類： ①兩種或多種誘變劑的先后使用； ②同一種誘變劑的重復(fù)使用； ③兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株（ original strain） ? 選用出發(fā)菌株的一般原則 ： ①最好是經(jīng)過生產(chǎn)中選育過的自發(fā)變異菌株； ②采用具有優(yōu)良性狀的菌株，如生長(zhǎng)速度快、營(yíng)養(yǎng)要求低以及產(chǎn)孢子早而多的菌株 ③選擇已發(fā)生其他變異的菌株作為出發(fā)菌株； ④細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)稱為增變菌株的變異菌株，更適宜作出發(fā)菌株； ⑤在選擇產(chǎn)核苷酸或氨基酸的出發(fā)菌株時(shí)，最好考慮至少能累積少量所需產(chǎn)物或其前體的菌株，而在選擇產(chǎn)抗生素的出發(fā)菌株時(shí)，最好選擇已通過幾次誘變并發(fā)現(xiàn)每次的效價(jià)都有一定程度提高的菌株作為出發(fā)菌株。 處理單孢子（或單細(xì)胞）懸液 ? 對(duì)單細(xì)胞微生物必須處理單細(xì)胞、均勻懸液的原因 ? 分散狀態(tài)的細(xì)胞可以均勻接觸誘變劑，避免長(zhǎng)出不純菌落。 ? 處理霉菌或放線菌孢子 的原因： ? 絲狀微生物的細(xì)胞內(nèi)同時(shí)含有幾個(gè)核，故某一突變無法反映在當(dāng)代的表型上。只有當(dāng)經(jīng)過 DNA的復(fù)制發(fā)生細(xì)胞分裂后，這一變異才會(huì)在表型上表達(dá)出來，于是出現(xiàn)了不純菌落，這就叫表型延遲（ phenotypic lag） （或由于誘變劑一般只作用于 DNA雙鏈中的某一條單鏈，也會(huì)出現(xiàn)表型延遲）。這也是誘變育種工作中初分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀“衰退”的主要原因。 ? 細(xì)胞的生理狀態(tài)對(duì)誘變的效果會(huì)發(fā)生很大的影響 。 ? 獲得均勻分散的細(xì)胞懸液的方法 ：用無菌的玻璃珠打碎成團(tuán)的細(xì)胞，然后再用脫脂棉過濾。誘變后出現(xiàn)的不純菌落，則可用適當(dāng)?shù)姆蛛x純化方法加以純化。 利用和創(chuàng)造形態(tài)、生理與產(chǎn)量間的相關(guān)指標(biāo) ?為了確切某一突變株產(chǎn)量性狀的提高程度，必須進(jìn)行大量的分析測(cè)定和統(tǒng)計(jì)工作，而一些形態(tài)變異雖能直接和迅速地加以觀察，但又不一定與產(chǎn)量變異相關(guān)。如果能找到這兩者間的相關(guān)性，則育種時(shí)初篩的效率就可大大提高。如在灰黃霉素產(chǎn)生菌蕁麻青霉的育種中，發(fā)現(xiàn)菌落的棕紅顏色變深者，產(chǎn)量往往有所提高； ?形態(tài)、生理與代謝產(chǎn)物產(chǎn)量間的相關(guān)性常?？赏ㄟ^人們的努力而加以創(chuàng)造。利用鑒別性培養(yǎng)基的原理或其它方法就可有效地把原來肉眼所觀察不到的生理性狀或產(chǎn)量性狀轉(zhuǎn)化為可見的“形態(tài)”性狀。例如，在瓊脂平板上，通過蛋白酶水解圈的大小、淀粉酶變色圈的大小，抗生素抑制圈的大小，生長(zhǎng)因子周圍某菌生長(zhǎng)圈的大小，以及外毒素的沉淀反應(yīng)圈的大小等，都可用于初篩工作中估計(jì)某菌產(chǎn)生相應(yīng)代謝產(chǎn)物能力的“形態(tài)”指標(biāo)。 選用最適劑量 ? 誘變劑劑量 一般指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。各種誘變劑有不同的劑量表示方式，如化學(xué)誘變劑以一定溫度下誘變劑的濃度和處理時(shí)間來表示。在育種實(shí)踐中，常以殺菌率來作誘變劑的相對(duì)劑量。 ? 誘變劑的合適劑量 ：凡在提高誘變率的基礎(chǔ)上，能擴(kuò)大變異幅度，促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。 ? 要確定一個(gè)合適的劑量，常常要經(jīng)過多次試驗(yàn) 。就一般微生物而言，在一定的劑量范圍內(nèi)，突變率往往隨劑量的增高而提高，但正變較多出現(xiàn)在偏低的劑量中，而負(fù)變則較多出現(xiàn)在偏高的劑量中；還發(fā)現(xiàn)經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株中，更容易出現(xiàn)負(fù)變。因此，在誘變育種工作中，目前大家比較傾向于采用較低的劑量。 篩選方案 ? 在實(shí)際工作中，一般認(rèn)為應(yīng)采用把篩選工程分為初篩與復(fù)篩兩個(gè)階段的篩選方案為好。前者以量（選留菌株的數(shù)量）為主，后者以質(zhì)（測(cè)定數(shù)據(jù)的精確度）為主。例如，在工作量限度為 200只搖瓶的具體條件下，為了取得更大的工效，有人提出了一些優(yōu)選的篩選方案（可參考有關(guān)專著） 篩選方法 ?一般通過初篩與復(fù)篩對(duì)突變株進(jìn)行生產(chǎn)性能的測(cè)定。 ?初篩既可在培養(yǎng)皿平板上進(jìn)行，也可在搖瓶中進(jìn)行，兩者各有利弊。 ?復(fù)篩是對(duì)突變株的生產(chǎn)性能作比較精確的定量測(cè)定。一般是將微生物搖瓶培養(yǎng)，然后再對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行分析測(cè)定。 ?不僅需要設(shè)計(jì)效率更高的篩選方法，還應(yīng)努力推廣篩選操作的自動(dòng)化。 .營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株的篩選 與篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株有關(guān)的三類培養(yǎng)基 ? 基本培養(yǎng)基 （ MM， minimal medium）：僅能滿足某微生物的野生型菌株生長(zhǎng)需要的最低成分組合培養(yǎng)基，稱基本培養(yǎng)基。可用符號(hào)“ [－ ]”來表示。 ? 完全培養(yǎng)基 （ CM， plete medium）：凡可滿足一切營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株?duì)I養(yǎng)需要的組合培養(yǎng)基，可稱為完全培養(yǎng)基?？捎梅?hào)“ [＋ ]”。 ? 補(bǔ)充培養(yǎng)基 （ SM， supplemental medium）：凡只能滿足相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)需要的組合培養(yǎng)基，稱為補(bǔ)充培養(yǎng)基。補(bǔ)充培養(yǎng)基的符號(hào)可根據(jù)加入的是 A或 B等代謝物而分別用 [A]或 [B]等來表示。 與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體 ? 野生型 ：從自然界分離到的任何微生物在其發(fā)生營(yíng)養(yǎng)缺陷突變前的原始菌株。 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 ：野生型菌株經(jīng)誘變處理后，喪失了某酶的合成能力，只能在加有該酶合成產(chǎn)物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，這類突變稱為營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株（簡(jiǎn)稱營(yíng)養(yǎng)缺陷型）。 ? 原養(yǎng)型 ：營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變經(jīng)回變或重組后產(chǎn)生的菌株，營(yíng)養(yǎng)要求在表型上與野生型相同。 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的篩選方法 ? 誘變劑處理 ? 淘汰野生型（抗生素法、菌絲過濾法） ? 檢出缺陷型（夾層培養(yǎng)法、限量補(bǔ)充培養(yǎng)法、逐個(gè)檢出法、影印接種法） ? 鑒定缺陷型（生長(zhǎng)譜法） 第七節(jié) 菌種的衰退、復(fù)壯和保藏 ?衰退與復(fù)壯的概念 衰退（ degeneration） ： 在微生物的生長(zhǎng)過程中，由于變異的存在，使原有的優(yōu)良性狀發(fā)生負(fù)變，即菌種的衰退。 復(fù)壯 (rejuvenation)： 狹義的復(fù)壯 是指在菌種已發(fā)生衰退的情況下，通過純種分離和生產(chǎn)性能測(cè)定等方法，從衰退的群體中找出未衰退的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)該菌原有典型性狀的措施； 廣義的復(fù)壯 是指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識(shí)的經(jīng)常、進(jìn)行純種的分離和生產(chǎn)性能測(cè)定工作，以期菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。實(shí)際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種 防止菌種衰退的方法 ?控制傳代的次數(shù) （一般在 DNA的復(fù)制過程中，堿基的錯(cuò)配率是 5x104，自發(fā)突變的頻率為 108~109，采用良好的菌種保藏方法，可以減少移種和傳代的次數(shù) ） ?創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 ?利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行接種傳代： 對(duì)絲狀微生物而言，通常采用穩(wěn)定的單核孢子進(jìn)行接種。 ?采用有效的菌種保藏方法 菌種的復(fù)壯措施 ?純種分離 菌落純的分離方法 （平板表面涂布法，平板劃線分離法，瓊脂培養(yǎng)基澆注法） 細(xì)胞純的分離方法 （分離小室進(jìn)行單細(xì)胞分離，顯微操縱器進(jìn)行單細(xì)胞分離，菌絲尖端切割法進(jìn)行單細(xì)胞分離） ?通過宿主體內(nèi)生長(zhǎng)進(jìn)行復(fù)壯 （如 Bacillus thuringiensis的復(fù)壯） ?淘汰已衰退的個(gè)體 （采用比較激烈的理化條件進(jìn)行處理，以殺死生命力較差的已衰退個(gè)體） 二、菌種的保藏 ?菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù) ： 廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株（包括病毒株以及動(dòng)、植物細(xì)胞株和質(zhì)粒等）的基礎(chǔ)上，使之達(dá)到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。 ?常用的菌種保藏機(jī)構(gòu) ： 中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì) (CCCCM) 美國(guó)的典型菌種保藏中心 (ATCC) 菌種保藏的原理 ?挑選典型菌種的優(yōu)良純種 一般采用微生物的休眠體（如孢子、芽孢等） ?創(chuàng)造適于微生物長(zhǎng)時(shí)期休眠的環(huán)境條件（如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或酸堿中和劑等） 菌種保藏的方法 菌 連續(xù)在培養(yǎng)基上（內(nèi)）移種 種 生活態(tài) 傳代培養(yǎng)保藏法 連續(xù)在活宿主上（內(nèi)）移種 保 固體斜面 藏 濕法 半固體瓊脂柱 方 休眠態(tài) 液體介質(zhì)（蒸餾水、糖液、其它溶液） 法 干法 藏在玻璃管內(nèi) 吸附在合適的載體上 干法保藏菌種的方法 滴入小試管（在放入大試管干燥器中） 藏在玻璃管內(nèi) 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法（ L干燥 法 ） 冷凍真空干燥法 細(xì)粒狀載體（土壤、沙粒、土壤 +沙粒） 球塊狀載體（硅膠、瓷球） 合適的載體 有機(jī)基質(zhì)（曲料、麥粒） 濾紙片 薄片狀載體 明膠小片 （滴在蠟紙板上干燥而成） 血清蛋白小片（ … 乙烯薄膜 … ） 幾種常用菌種保藏方法的比較 方法名稱 主要措施 適宜菌種 保藏期 評(píng)價(jià) 冰箱保藏法（斜面） 冰箱保藏法（半固體） 石蠟油封藏法 * 沙土保藏法 冷凍干燥法 低溫 低溫 低溫、缺氧 干燥、無營(yíng)養(yǎng) 干燥、無氧、低溫、有保護(hù)劑 各大類 細(xì)菌、酵母菌 各大類 ** 產(chǎn)孢子微生物 各大類 3~6月 6~12月 1~2年 1~10年 5~15年以上 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便 簡(jiǎn)便有效 簡(jiǎn)便、有效 二 、 遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的存在部位和方式 ? （一）核酸存在的七個(gè)水平及質(zhì)粒 ? 細(xì)胞水平： 存在于細(xì)胞核或核質(zhì)體 ? 細(xì)胞核水平： 單核或多核結(jié)構(gòu) ? 染色體水平： 倍性 (真核 )和染色體數(shù) ? 核酸水平：在原核中同染色體水平、存在部分二倍體 DNA或 RNA，復(fù)合或裸露，雙鏈或單鏈 ? 基因水平：一切具有自主復(fù)制能力的遺傳 功能單位均可稱為基因。 1000bp大小， 分子量約 105Dalton ? 密碼子水平： 第三位模糊 ,起始和終止 ,信息單位 ? 核苷酸水平： 突變或交換單位 ? （ colicinogenic factor） ? 產(chǎn)大腸桿菌素因子。大腸桿菌素是一種由 某些菌株所分泌的細(xì)菌素，具有通過抑制復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯或能量代謝等而專一地殺死其它腸道細(xì)菌的功能。大腸桿菌素都是由質(zhì)粒 ——Col因子編碼的。 ? Col因子可分為兩類，分別以 ColE1和 Col I b為代表。前者分子量小，約為 5 106Dalton，無接合作用，是多 copy的；后者的分子量約為 80 106Dalton，它與 F因子相似，具有通過接合作用轉(zhuǎn)移的功能，屬于嚴(yán)緊型控制，只有 1~2個(gè) copy。 凡帶 Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對(duì)大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。 ? ColE1研究得很多，并被廣泛地用于重組 DNA 的研究和用于體外復(fù)制系統(tǒng)上。 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) (abortive transduction) ? 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) ：經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得了供體菌 DNA片斷的受體菌，如果外源 DNA在其內(nèi)僅進(jìn)行轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯和性狀表達(dá)，這種現(xiàn)象稱為流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（ gene