細(xì)菌的遺傳與變異-醫(yī)學(xué)微生物學(xué)-資料下載頁(yè)
2025-01-18 02:32本頁(yè)面
【正文】 蛋白 五、基因工程菌株的構(gòu)建 重組 DNA技術(shù) 基因工程菌 五、基因工程菌株的構(gòu)建 質(zhì)粒作為一種獨(dú)立的復(fù)制子，容易從細(xì)胞中分離出來(lái)、在體外進(jìn)行遺傳操作和轉(zhuǎn)入到合適的受體細(xì)胞中，表達(dá)外源目的基因。 ● 自主復(fù)制， 可表達(dá)外源基因 ● 限制性酶切位點(diǎn) ● 選擇性標(biāo)記（耐藥性） 五、基因工程菌株的構(gòu)建 質(zhì)粒可作為表達(dá)載體，首先在體外構(gòu)建重組質(zhì)粒（攜帶目的基因）；再轉(zhuǎn)入原核表達(dá)系統(tǒng) （大腸桿菌） 或真核表達(dá)系統(tǒng)（酵母菌） 中，構(gòu)建“基因工程菌株”；大量表達(dá)目的基因，獲得目的蛋白 （如氨基酸、味精、抗生素、胰島素、干 擾素、生長(zhǎng)激素、乙肝疫苗） 。 五、基因工程菌株的構(gòu)建 幽門螺桿菌 （ Helicobacter pylori， Hp）是慢性活動(dòng)性胃炎和消化性潰瘍的致病菌，并與胃腺癌 和胃部淋巴瘤的 發(fā)生密切相關(guān)。 立論依據(jù) 五、基因工程菌株的構(gòu)建 我國(guó)人口 Hp感染率為 70%。目前主要采用的抗生素療法（三聯(lián)藥物 :埃索美拉唑＋阿莫西林＋克拉霉素 ）的療效不甚理想，易復(fù)發(fā)。 疫苗被認(rèn)為是控制 Hp感染最有效的方法。 五、基因工程菌株的構(gòu)建 ● 全菌滅活疫苗 ● 亞單位疫苗 由于以上疫苗各自的缺陷，目前尚無(wú)安全、有效的疫苗應(yīng)用于臨床。鑒于 Hp經(jīng)黏膜途徑入侵人體，黏 膜免疫在抗感染免疫中起 有重要作用。 五、基因工程菌株的構(gòu)建 構(gòu)建高效表達(dá)幽門螺桿菌保護(hù)性抗原 黏附素的重組嗜酸乳酸菌，作為 活載體口服疫苗 ，誘發(fā)有效的局部免疫應(yīng)答，保護(hù)機(jī)體抵抗感染。 五、基因工程菌株的構(gòu)建 設(shè)計(jì)幽門螺桿菌黏附素Bab引物，引入酶切位點(diǎn) 培養(yǎng)幽門螺桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株 抽提核酸 PCR擴(kuò)增 Bab基因 構(gòu)建表達(dá)載體 pMD18T 轉(zhuǎn)化進(jìn) DH5α 受體菌，篩選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)菌 抽提質(zhì)粒 雙酶切，鑒定，回收 Bab片斷 克隆入嗜酸乳桿菌質(zhì)粒 pMG36e 電穿孔法轉(zhuǎn)化 在嗜酸乳桿菌中表達(dá)，獲得重組嗜酸乳桿菌 鑒定目的蛋白表達(dá)效果 pMG36e是組成型表達(dá)質(zhì)粒載體，可在乳酸菌、大腸桿菌中自我復(fù)制 。大小為，含紅霉素耐藥基因、 P32啟動(dòng)子、多克隆位點(diǎn)和 prtp轉(zhuǎn)錄終止子。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 引物設(shè)計(jì) : P1 5’GGAATTCATGAAAACATTTGAA3’ EcoR I P2 5 ’GCTCGAGTTAAGCCAAATGGGC3’ Xho I 五、基因工程菌株的構(gòu)建 2022bp 1000bp 750bp 500bp 250bp 100bp ① PCR擴(kuò)增 Bab基因 五、基因工程菌株的構(gòu)建 ② Bab基因測(cè)序及序列分析 五、基因工程菌株的構(gòu)建 ③ Bab基因克隆至表達(dá)載體 bp 1000 15000 7500 5000 2500 M 1 2 1： EcoR I/Xho I雙酶 切重組質(zhì)粒 2： PCR 擴(kuò)增 Bab基因 五、基因工程菌株的構(gòu)建 5 . 0 4 . 0 3 . 0 2 . 0 1 . 00 . 01 . 02 . 03 . 04 . 05 . 01 14437 73 109n a p A . s e q _ Tr a n s l a t i o nHydrophilicityP o s i t i o n④ Bab生物信息學(xué)分析 五、基因工程菌株的構(gòu)建 ⑤ Bab在嗜酸乳桿菌中的表達(dá) M 1 2 3 Kda Kda M 1 2 五、基因工程菌株的構(gòu)建 哈哈， 下 課 了 !
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