【正文】 60。↓←↓← 搖瓶發(fā)酵試驗搖瓶發(fā)酵試驗w 選出突變體（根據(jù)情況進行生產(chǎn)試驗或選出突變體（根據(jù)情況進行生產(chǎn)試驗或重復誘變處理）重復誘變處理）二、微生二、微生物的誘變物的誘變育種育種二、微生二、微生物的誘變物的誘變育種育種（二）變異菌株的初步篩選（二）變異菌株的初步篩選紙片培養(yǎng)顯色法紙片培養(yǎng)顯色法 透明圈法透明圈法瓊脂塊培養(yǎng)法瓊脂塊培養(yǎng)法 1 篩選用培養(yǎng)基篩選用培養(yǎng)基⑴ 基本培養(yǎng)基：凡是能滿足某種野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分基本培養(yǎng)基：凡是能滿足某種野生型菌株營養(yǎng)要求的最低成分的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基；常以的合成培養(yǎng)基，稱為基本培養(yǎng)基；常以 ‘‘ []’’ 表示；表示；⑵ 在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類在基本培養(yǎng)基中加入一些富含氨基酸、維生素及含氮堿基之類的天然有機物質(zhì)如蛋白胨、酵母膏等，以滿足該微生物的各種的天然有機物質(zhì)如蛋白胨、酵母膏等，以滿足該微生物的各種營養(yǎng)缺陷型菌株都能生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基，常營養(yǎng)缺陷型菌株都能生長繁殖的培養(yǎng)基，稱為完全培養(yǎng)基，常用用 ‘‘ [+]’’ 表示；表示；⑶ 在基本培養(yǎng)基中只是有針對性地加入某一種或某幾種營養(yǎng)缺陷在基本培養(yǎng)基中只是有針對性地加入某一種或某幾種營養(yǎng)缺陷成分，以滿足相應的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)成分，以滿足相應的營養(yǎng)缺陷型生長的培養(yǎng)基，稱為補充培養(yǎng)基，補充培養(yǎng)基可按所加入營養(yǎng)成分相應地用基，補充培養(yǎng)基可按所加入營養(yǎng)成分相應地用 ‘‘ [A]’’ 、 ‘‘ [B]’’等來表示。等來表示。（三）營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及其應用（三）營養(yǎng)缺陷型突變體的篩選及其應用二、微生物的二、微生物的誘變育種誘變育種2．營養(yǎng)缺陷型菌株篩選的一般方法 （（ 1）誘變劑處理）誘變劑處理 （（ 2）淘汰野生型菌株）淘汰野生型菌株 ① 抗生素法抗生素法 ② 菌絲過濾法菌絲過濾法（（ 3）） 檢檢 出出 營營 養(yǎng)缺陷型養(yǎng)缺陷型 （（ 4）） 鑒鑒 定定 營營 養(yǎng)缺陷型養(yǎng)缺陷型 檢出營養(yǎng)缺陷型檢出營養(yǎng)缺陷型①① 夾層培養(yǎng)法夾層培養(yǎng)法 ② 限量補充培養(yǎng)法限量補充培養(yǎng)法 ③ 影印接種法影印接種法 ④④ 逐個檢出法逐個檢出法 鑒定營養(yǎng)缺陷型鑒定營養(yǎng)缺陷型① 含營養(yǎng)缺陷型菌株的基本培養(yǎng)基平板的制備。含營養(yǎng)缺陷型菌株的基本培養(yǎng)基平板的制備。w ② 營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)類別的鑒定。營養(yǎng)缺陷型營養(yǎng)類別的鑒定。 w ③ 缺陷型菌株單一營養(yǎng)因素的鑒定。缺陷型菌株單一營養(yǎng)因素的鑒定。 20種氨基酸的排列編組 第一組第一組 第二組第二組 第三組第三組 第四組第四組 第五組第五組第六組第六組第七組第七組第八組第八組第九組第九組丙氨酸丙氨酸谷氨酸谷氨酸亮氨酸亮氨酸絲氨酸絲氨酸精氨酸精氨酸谷氨酰氨谷氨酰氨賴氨酸賴氨酸蘇氨酸蘇氨酸天冬酰氨天冬酰氨甘氨酸甘氨酸蛋氨酸蛋氨酸色氨酸色氨酸天冬氨酸天冬氨酸組氨酸組氨酸苯丙氨酸苯丙氨酸酪氨酸酪氨酸半胱氨酸半胱氨酸異亮氨酸異亮氨酸脯氨酸脯氨酸 纈氨酸纈氨酸原生質(zhì)體融合育種原生質(zhì)體融合育種 w 細胞（細胞（ A+B—— ）） 細胞（細胞（ A—— B+））w 脫壁處理脫壁處理 脫壁處理脫壁處理w 原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（ A+B—— ）） 原生質(zhì)體（原生質(zhì)體（ A—— B+））w 混合混合w w 加融合劑加融合劑w 原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合w 涂平板（原生質(zhì)體再生）涂平板（原生質(zhì)體再生）w 形成菌落形成菌落w w 檢出重組子菌落（檢出重組子菌落（ A+B+））轉(zhuǎn)基因工程菌株的構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌株的構(gòu)建w 1．提取目的基因 用密度梯度離心方法分別從供體細胞中提取所需要的 DNA即目的基因和作為載體的細菌質(zhì)粒或噬菌體核酸，目的基因也可通過化學方法人工合成。w 2．處理目的基因 根據(jù)基因工程的 “ 設計藍圖 ” 的要求，在從供體細胞中提取出的目的基因中加入專一性很強的限制性核酸內(nèi)切酶進行處理，從而獲得帶有特定基因并暴露出粘性末端的DNA單鏈部分。必要時這種粘性末端也可用人工方法合成。w 對作為載體的細菌質(zhì)粒或噬菌體 DNA可采用與處理目的基因同一種類的限制性核酸內(nèi)切酶進行處理，使其形成并暴露出與目的基因相應的粘性末端。w 3．體外重組 將上述分別處理過的目的基因和細菌質(zhì)粒 DNA片段（或噬菌體核酸）放在試管中，在較低溫度（ 5～ 6℃ ）下混合 “ 退火 ” 。由于這兩種 DNA是用同一種限制性核酸內(nèi)切酶進行處理，具有相同的粘性末端，因此相互之間能夠形成氫鍵，這就是所謂 “ 退火 ” 。而相鄰的核苷酸，在 DNA連接酶的作用下也能形成磷酸二酯鍵，這樣就完成了目的基因與質(zhì)粒 DNA（ 或噬菌體 DNA） 的重組，得到的是一個完整的具有復制能力的環(huán)狀 DNA重組體，即 “ 雜種質(zhì)粒 ”（或雜種噬菌體）。w 4．載體傳遞 即通過載體將供體生物中的遺傳基因?qū)氲绞荏w細胞內(nèi)。載體必須具有自我復制的能力，一般可利用質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化作用或噬菌體的轉(zhuǎn)導作用，將供體基因帶入受體細胞內(nèi)。w 5．復制、表達 在理想情況下，進入受體細胞內(nèi)的雜種質(zhì)粒（或雜種噬菌體），可通過自我復制到擴增，并使受體細胞表達出作為供體細胞所固有的部分遺傳性狀，成為 “ 工程菌 ” 。w 6．篩選、繁殖 當前，由于分離純凈的基因功能單位還很困難，所以通過重組后的 “ 雜種質(zhì)粒 ” 的性狀是否都符合原定的 “ 設計藍圖 ” ，以及它能否在受體細胞內(nèi)正常增殖和表達等，都還需要經(jīng)過仔細檢查，以便能在大量個體中設法篩選出所需要性狀的個體，然后才可加以繁殖和利用。第五節(jié)第五節(jié) 微生物菌種的保藏和復壯微生物菌種的保藏和復壯一、菌種的保藏一、菌種的保藏 w 1．低溫保藏法．低溫保藏法 斜面菌種直接放入斜面菌種直接放入 0～～ 4℃℃ 冰箱中保藏，保存時冰箱中保藏，保存時間不宜過長，一般為間不宜過長，一般為 3～～ 6個月；個月； 用用 20℃℃ 以下的超低溫冰箱或干以下的超低溫冰箱或干冰、液氮（冰、液氮（ 195℃℃ ）凍結(jié)保藏，長達數(shù)年。）凍結(jié)保藏，長達數(shù)年。 w 2．干燥保藏法．干燥保藏法 主要是指把菌種接種到適當載體上，在干燥條件主要是指把菌種接種到適當載體上，在干燥條件下進行保藏。這種保藏方法主要適合于細菌的芽胞和霉菌的孢子。下進行保藏。這種保藏方法主要適合于細菌的芽胞和霉菌的孢子。細菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麩皮管保藏。細菌芽胞用沙土管保藏；霉菌的孢子多用麩皮管保藏。w 3．隔絕空氣保藏法．隔絕空氣保藏法 用固體石蠟密封試管口以隔絕空氣，用固體石蠟密封試管口以隔絕空氣， w 4．真空冷凍干燥保藏法．真空冷凍干燥保藏法 其基本過程是：培養(yǎng)菌種其基本過程是：培養(yǎng)菌種 →→ 加菌種保加菌種保護劑（一般食品工業(yè)用菌種多用牛乳作保護劑）護劑（一般食品工業(yè)用菌種多用牛乳作保護劑） →→ 分裝、預凍分裝、預凍 →→ 真真空凍干空凍干 →→ 真空封口。真空封口。 w 5．寄主保藏法．寄主保藏法 用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒。用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒。w 第五節(jié)第五節(jié) 微生物菌種的保藏和復壯微生物菌種的保藏和復壯二、菌種的退化與復壯二、菌種的退化與復壯（一）（一） 常見的菌種退化現(xiàn)象常見的菌種退化現(xiàn)象（二）（二） 菌種退化的原因菌種退化的原因菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。 （三）（三） 防止菌種退化的措施防止菌種退化的措施 1．控制傳代次數(shù)．控制傳代次數(shù) 2．創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件．創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 3．利用不同類型的細胞進行移種傳代．利用不同類型的細胞進行移種傳代 4．采用有效的菌種保藏方法．采用有效的菌種保藏方法 （四）（四） 退化菌種的復壯退化菌種的復壯謝謝觀看 /歡迎下載BY FAITH I MEAN A VISION OF GOOD ONE CHERISHES AND THE ENTHUSIASM THAT PUSHES ONE TO SEEK ITS FULFILLMENT REGARDLESS OF OBSTACLES. BY FAITH I BY FAITH