【正文】 原理首先應(yīng)該挑選典型菌種的優(yōu)良純種來進(jìn)行保藏，最好保藏它們的休眠體，如分生孢子、芽孢等。其次，應(yīng)根據(jù)微生物生理、生化特點，人為地創(chuàng)造環(huán)境條件，使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。這些人工造成的環(huán)境主要是干燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。干燥尤其是深度干燥，在菌種保藏中占有首要地位。五氧化二磷、無水氯化鈣和硅膠是良好的干燥劑。高度真空可以同時達(dá)到驅(qū)氧和深度干燥的雙重目的。低溫是菌種保藏中的另一重要條件。低溫必須與干燥結(jié)合，才具有良好的保藏效果。在低溫保藏中，細(xì)胞體積較大者一般要比較小者對低溫敏感，無細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁者敏感。原因：低溫會使細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞膜的損傷。放到低溫70℃下進(jìn)行冷凍時，適當(dāng)采用速凍的方法，可使產(chǎn)生的冰晶小而減少對細(xì)胞的損傷。當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時，冰晶又會長大，此時快速升溫也可減少對細(xì)胞的損傷。不同微生物的最適冷凍速度和升溫速度不同。例如：酵母菌的冷凍速度以10℃/min為宜，而紅細(xì)胞則相應(yīng)地為20℃/min。適宜的介質(zhì)：／L左右的甘油或二甲亞砜可透入細(xì)胞，并通過強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清白蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)雖不能透入細(xì)胞，但可能是通過與細(xì)胞表面結(jié)合的方式而防止細(xì)胞膜受凍傷。用極低的溫度進(jìn)行保藏時效果更為理想，如液氮溫度(196℃)比干冰溫度(70℃)好，70℃又比20℃好，而20℃比4℃好?！铮ㄈ┚N保藏的方法良好的有效保藏方法，首先應(yīng)能保持原菌種的優(yōu)良性狀長期不變，同時還須考慮方法的通用性、操作的簡便性和設(shè)備的普及性。幾種常用的菌種保藏方法：（1）斜面低溫保藏法方法：將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。適用對象：細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。放線菌、霉菌和有芽孢的細(xì)菌一般可保存6個月左右，無芽孢的細(xì)菌可保存1個月左右，酵母菌可保存3個月左右。如以橡皮塞代替棉塞，再用石蠟封口，置于4℃冰箱中保藏，不僅能防止水分揮發(fā)、能隔氧，而且能防止棉塞受潮而污染。這一改進(jìn)可使菌種的保藏期延長。原理：由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。優(yōu)點：簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。缺點：菌株仍有一定程度的代謝活動能力，保藏期短，傳代次數(shù)多，菌種較容易發(fā)生變異和被污染。（2）石蠟油封藏法方法：在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無毒，化學(xué)純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。原理：由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會干裂，因而能使保藏期達(dá)1～2年，或更長。適用對象：適于保藏霉菌、酵母菌、放線菌、好氧性細(xì)菌等，對霉菌和酵母菌的保藏效果較好，可保存幾年，甚至長達(dá)10年。但對很多厭氧性細(xì)菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％。（3）砂土管保藏法適用對象：適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細(xì)菌，對于一些對干燥敏感的細(xì)菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。制作方法：先將砂與土分別洗凈、烘干、過篩(一般砂用60目篩，土用120目篩)，按砂與土的比例為(1～2)：1混勻，分裝于小試管中，砂土的高度約1cm，以121℃蒸汽滅菌1～，間歇滅菌3次。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。也有只用砂或土作載體進(jìn)行保藏的。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無菌水制成108～1010個/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏，后者效果更好。優(yōu)點：砂土管法兼具低溫、干燥、隔氧和無營養(yǎng)物等條件，保藏期較長、效果較好，且微生物移接方便，經(jīng)濟(jì)簡便。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。中國科學(xué)院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線菌。（4）麩皮保藏法（曲法保藏）方法：以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。制作方法：按照不同菌種對水分要求的不同將麩皮與水以一定的比例1：(～)拌勻，裝量為試管體積2/5，濕熱滅菌后經(jīng)冷卻，接入新鮮培養(yǎng)的菌種，適溫培養(yǎng)至孢子長成。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。適用對象：產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線菌，保藏期在1年以上。優(yōu)點：操作簡單，經(jīng)濟(jì)實惠，工廠較多采用。中國科學(xué)院微生物研究所采用麩皮保藏法保藏曲霉，如米曲霉、黑曲霉、泡盛曲霉等，其保藏期可達(dá)數(shù)年至數(shù)十年。（5）甘油懸液保藏法方法：將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏。特點：較簡便，但需置備低溫冰箱保藏溫度若采用20℃，～1年，而采用70℃，保藏期可達(dá)10年。制作方法：將擬保藏菌種對數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏。適用對象：基因工程菌。（6）冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。制作方法：用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常用的保護(hù)劑：脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。優(yōu)點：同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法。缺點：操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。（7）液氮超低溫保藏法簡稱液氮保藏法或液氮法。方法：以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（196℃）下保藏的方法。主要原理：菌種細(xì)胞從常溫過渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過細(xì)胞膜外滲出來，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。美國ATCC菌種保藏中心把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以每分鐘下降1℃/min 的速度從0℃直降到35℃，然后保藏在150℃～196℃液氮冷箱中。如果降溫速度過快，由于細(xì)胞內(nèi)自由水來不及滲出胞外，形成冰晶就會損傷細(xì)胞。降溫的速度控制在(1～10)℃/min，細(xì)胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應(yīng)提高。保護(hù)劑：一般選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不同微生物要選擇不同的保護(hù)劑，再通過試驗加以確定保護(hù)劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。優(yōu)點：①此法操作簡便、高效、保藏期一般可達(dá)到15年以上，是目前被公認(rèn)的最有效的菌種長期保藏技術(shù)之一。該法適用于各種微生物菌種的保藏（除少數(shù)對低溫?fù)p傷敏感的微生物外），藻類、原生動物、支原體都能用此法保藏。②可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏，無論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。缺點：需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費用較高。要使用菌種時，從液氮罐中取出安瓿瓶，并迅速放到35～40℃溫水中，使之冰凍熔化，以無菌操作打開安瓿瓶，移接到保藏前使用的同一種培養(yǎng)基斜面上進(jìn)行培養(yǎng)。從液氮罐中取出安瓿瓶時速度要快，一般不超過1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量。取樣時一定要戴專用手套以防止意外爆炸和凍傷。（8）宿主保藏法適用于專性活細(xì)胞寄生微生物（如病毒、立克次氏體等）。在上述的菌種保藏方法中，斜面低溫保藏法、石蠟油封藏法、宿主保藏法最為簡便，砂土管保藏法、麩皮保藏法和甘油懸液保藏法次之；冷凍真空干燥保藏法和液氮超低溫保藏法最復(fù)雜，但保藏效果最好。應(yīng)用時，可根據(jù)實際需要選用。 美國典型培養(yǎng)物收藏中心(簡寫ATCC)，僅采用兩種最有效的保藏法：保藏期一般達(dá)5～15年的冷凍真空干燥保藏法與保藏期一般達(dá)15年以上的液氮超低溫保藏法，以達(dá)到最大限度地減少傳代次數(shù)，避免菌種變異和衰退的目的。我國菌種保藏多采用3種方法：斜面低溫保藏法、液氮超低溫保藏法和冷凍真空干燥保藏法。（四）、目前國內(nèi)外主要菌種保藏機(jī)構(gòu)（1）國內(nèi)主要菌種保藏機(jī)構(gòu) 單位簡稱單 位 名 稱單位簡稱單 位 名 稱CCCCM中國微生物菌種保藏管理委員會NICPBP衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所CGMCC中國普通微生物菌種保藏中心－中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所AS中國科學(xué)院微生物研究所CACC中國抗生素微生物菌種保藏中心ASIV中國科學(xué)院武漢病毒研究所IEM中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所ACCC中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心SIA四川抗生素研究所ISF中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤與肥料研究所IANP石家莊華北制藥廠抗生素研究所CICC中國工業(yè)微生物菌種保藏中心CVCC中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心IFFI中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院NCIVBP農(nóng)業(yè)部獸藥監(jiān)察研究所CMCC中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心CFCC中國林業(yè)微生物菌種保藏中心ID中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所RIF中國林業(yè)科學(xué)院林業(yè)研究所（2）國外部分菌種保藏機(jī)構(gòu)單位簡稱單位名稱單位簡稱單位名稱ATCC美國典型培養(yǎng)物收藏中心NCTC國家典型菌種保藏中心（英國）NRRL北方開發(fā)利用研究部（美國）IAM東京大學(xué)應(yīng)用微生物研究所(日本)CBS霉菌中心保藏所（荷蘭）CCTM法國典型微生物保藏中心NCIB英國國立工業(yè)細(xì)菌菌庫CMI英聯(lián)邦真菌研究所IFO大阪發(fā)酵研究所（日本）SSI國立血清研究所ATCC美國典型培養(yǎng)物收藏中心WHO世界衛(wèi)生組織42 / 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