【正文】 板上的相應(yīng)部位卻呈空白，說(shuō)明這就是一個(gè)營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。（一）轉(zhuǎn)化概念：受體菌直接吸收來(lái)自供體菌的DNA片段，通過(guò)交換將其整合到自己的基因組中，從而獲得了供體菌部分遺傳性狀的現(xiàn)象稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。來(lái)自供體的單鏈DNA片段在細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)、重組，形成一小段雜合DNA區(qū)段。體內(nèi)僅含有供體DNA的缺陷噬菌體稱(chēng)完全缺陷噬菌體。研究細(xì)菌接合的營(yíng)養(yǎng)缺陷型法原理細(xì)胞的接合現(xiàn)象在大腸桿菌中研究得最清楚。Hfr菌株中的F因子有時(shí)可由不正常的切割而帶有一小段核染色體基因的雜合F因子，通常稱(chēng)為F′因子。（一）有性雜交概念：有性雜交一般指不同遺傳型的兩性細(xì)胞間發(fā)生的接合和隨之進(jìn)行的染色體重組，進(jìn)而產(chǎn)生新遺傳型后代的一種育種技術(shù)。生產(chǎn)實(shí)踐中利用有性雜交培育優(yōu)良品種的例子很多。2. 形成異核體兩個(gè)遺傳型有差異的體細(xì)胞經(jīng)菌絲聯(lián)結(jié)后，先發(fā)生質(zhì)配，使原有的兩個(gè)單倍體核集中到同一個(gè)細(xì)胞中，形成雙相異核體。是一種自覺(jué)的、可人為操縱的體外DNA重組技術(shù)，是一種可達(dá)到超遠(yuǎn)緣雜交的育種技術(shù)，更是一種前景寬廣、正在迅速發(fā)展的定向育種新技術(shù)。由于每一種限制性?xún)?nèi)切酶所切斷的雙鏈DNA片段的粘性末端有相同的核苷酸組分，所以當(dāng)兩者相混時(shí)，凡粘性末端上堿基互補(bǔ)的片段，就會(huì)因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈。②將木質(zhì)素分解酶的基因或纖維素分解酶的基因重組到酵母菌內(nèi)，使酵母菌能充分利用稻草、木屑等地球上貯量極大并可持續(xù)利用的廉價(jià)原料來(lái)直接生產(chǎn)酒精，可望為人類(lèi)開(kāi)辟一個(gè)取之不盡的新能源和化工原料來(lái)源；③改良和培育農(nóng)作物和家畜、家禽新品種,包括提高光合作用效率以及各種抗性(植物的抗鹽、抗旱、抗病基因，魚(yú)的抗凍蛋白基因)等。我國(guó)學(xué)者已研制了兼具蘇云金桿菌和昆蟲(chóng)桿狀病毒優(yōu)點(diǎn)的新型基因工程病毒殺蟲(chóng)劑，還研究成功重組有蝎毒基因的棉鈴蟲(chóng)病毒殺蟲(chóng)劑，它們都是高效、無(wú)公害的，堪稱(chēng)是生物農(nóng)藥領(lǐng)域中的一大創(chuàng)新。這些研究工作的順利開(kāi)展，將極大地推動(dòng)人類(lèi)對(duì)生命現(xiàn)象和生命規(guī)律的認(rèn)識(shí)，促進(jìn)人類(lèi)文明的發(fā)展，并為生物技術(shù)發(fā)展成為21世紀(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)做出重要貢獻(xiàn)。：目的是盡可能保持菌種原有性狀和活力的穩(wěn)定，使其不死、不變、不被污染，以提供給科研、生產(chǎn)和實(shí)驗(yàn)的需要。4. 致病菌對(duì)宿主侵染能力下降。雖然自發(fā)突變的幾率很低(一般為106～109)，但因微生物有極強(qiáng)的代謝繁殖能力，隨著傳代次數(shù)增加，衰退細(xì)胞的數(shù)目就會(huì)不斷增加，在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢(shì)，最終成為衰退的菌株。2. 創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件創(chuàng)造一個(gè)適合原種的良好培養(yǎng)條件，可以防止菌種衰退。二、菌種的復(fù)壯（一）復(fù)壯狹義的復(fù)壯：指在菌種已經(jīng)發(fā)生衰退的情況下，通過(guò)純種分離和測(cè)定典型性狀、生產(chǎn)性能等指標(biāo)，從已衰退的群體中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的相應(yīng)措施。對(duì)于不長(zhǎng)孢子的絲狀菌，則可用無(wú)菌小刀切取菌落邊緣的菌絲尖端進(jìn)行分離移植，也可用無(wú)菌毛細(xì)管截取菌絲尖端單細(xì)胞進(jìn)行純種分離。這些人工造成的環(huán)境主要是干燥、低溫和缺氧，另外，避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)、添加保護(hù)劑或酸度中和劑也能有效提高保藏效果。放到低溫70℃下進(jìn)行冷凍時(shí)，適當(dāng)采用速凍的方法，可使產(chǎn)生的冰晶小而減少對(duì)細(xì)胞的損傷。適用對(duì)象：細(xì)菌、放線(xiàn)菌、酵母菌和霉菌等大多數(shù)微生物菌種的短期保藏及不宜用冷凍干燥保藏的菌種。使用的液體石蠟要求優(yōu)質(zhì)無(wú)毒，化學(xué)純規(guī)格，其滅菌條件是：150～170℃烘箱內(nèi)滅菌lh；或121℃高壓蒸汽滅菌60～80min，再置于80℃的烘箱內(nèi)烘干除去水分。也有只用砂或土作載體進(jìn)行保藏的。適用對(duì)象：產(chǎn)孢子的霉菌和某些放線(xiàn)菌，保藏期在1年以上。制作方法：用保護(hù)劑制備擬保藏菌種的細(xì)胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。主要原理：菌種細(xì)胞從常溫過(guò)渡到低溫，并在降到低溫之前，使細(xì)胞內(nèi)的自由水通過(guò)細(xì)胞膜外滲出來(lái)，以免膜內(nèi)因自由水凝結(jié)成冰晶而使細(xì)胞損傷。②可使用各種培養(yǎng)形式的微生物進(jìn)行保藏，無(wú)論是孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可采用該保藏法。 美國(guó)典型培養(yǎng)物收藏中心(簡(jiǎn)寫(xiě)ATCC)，僅采用兩種最有效的保藏法：保藏期一般達(dá)5～15年的冷凍真空干燥保藏法與保藏期一般達(dá)15年以上的液氮超低溫保藏法，以達(dá)到最大限度地減少傳代次數(shù)，避免菌種變異和衰退的目的。取樣時(shí)一定要戴專(zhuān)用手套以防止意外爆炸和凍傷。保護(hù)劑：一般選擇甘油、二甲基亞砜、糊精、血清蛋白、聚乙烯氮戊環(huán)、吐溫80等，但最常用的是甘油（10%～20%）。不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法。特點(diǎn)：較簡(jiǎn)便，但需置備低溫冰箱保藏溫度若采用20℃，～1年，而采用70℃，保藏期可達(dá)10年。中國(guó)科學(xué)院微生物研究所用砂土管保藏法保藏放線(xiàn)菌。此法用于保藏紅曲霉很合適，保藏1～2年后存活率為100％。原理：由于采用低溫保藏，大大減緩了微生物的代謝繁殖速度，降低突變頻率；同時(shí)也減少了培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，使其不至于干裂。適宜的介質(zhì)：／L左右的甘油或二甲亞砜可透入細(xì)胞，并通過(guò)強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清白蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)雖不能透入細(xì)胞，但可能是通過(guò)與細(xì)胞表面結(jié)合的方式而防止細(xì)胞膜受凍傷。低溫是菌種保藏中的另一重要條件。4. 遺傳育種法即把退化的菌種，重新進(jìn)行遺傳育種，從中再選出高產(chǎn)而不易退化的穩(wěn)定性較好的生產(chǎn)菌種。例如采用稀釋平板法、涂布平板法、平板劃線(xiàn)法等方法獲得單菌落。4. 采用有效的菌種保藏方法斜面冰箱保藏法只適用于短期保藏；需要長(zhǎng)期保藏的菌種，應(yīng)當(dāng)采用砂土保藏法、冷凍干燥保藏法及液氮保藏法等方法。2. 連續(xù)傳代是加速菌種衰退的一個(gè)重要原因。★（二）菌種衰退的原因菌種衰退是從量變到質(zhì)變的逐步演變過(guò)程。菌種衰退的具體表現(xiàn)：1. 菌落和細(xì)胞形態(tài)改變。：“狹義的復(fù)壯”：從已衰退的菌種中篩選出少數(shù)尚未退化的個(gè)體，以達(dá)到恢復(fù)原菌株固有性狀的方法。（二）基因工程的發(fā)展前景近年來(lái)，基因工程已成為生物科學(xué)與技術(shù)的核心技術(shù)，基因工程本身也有了重大的進(jìn)展和外延。 4. 基因工程在環(huán)境保護(hù)方面的應(yīng)用利用基因工程可獲得同時(shí)能分解多種有毒物質(zhì)的新型菌種。把重組載體DNA分子引入受體細(xì)胞的方法很多：可以用轉(zhuǎn)化的手段也可用感染的方法。目前原核受體細(xì)胞的載體主要有細(xì)菌質(zhì)粒(松弛型)和λ噬菌體兩類(lèi)。4. 體細(xì)胞交換和單倍體化體細(xì)胞交換即體細(xì)胞中染色體間的交換，也稱(chēng)有絲分裂交換。它可使同一生物的兩個(gè)不同來(lái)源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過(guò)減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。用蒸餾水洗下子囊，經(jīng)機(jī)械研磨法或蝸牛酶酶解法破壞子囊，再經(jīng)離心，然后用獲得的子囊孢子涂布平板，就可以得到單倍體菌落。主要操作步驟：先選擇兩株有特殊價(jià)值、并帶有選擇性遺傳標(biāo)記的細(xì)胞作為親本菌株置于等滲溶液中，用適當(dāng)?shù)拿摫诿福ㄈ缂?xì)菌和放線(xiàn)菌可用溶菌酶等處理，真菌可用蝸牛消化酶或其他相應(yīng)酶處理）去除細(xì)胞壁，再將形成的原生質(zhì)體（包括球狀體）進(jìn)行離心聚集，加入促融合劑PEG(聚乙二醇)或借電脈沖等因素促進(jìn)融合，然后用等滲溶液稀釋?zhuān)偻吭谀艽偈顾偕?xì)胞壁和進(jìn)行細(xì)胞分裂的基本培養(yǎng)基平板上。F＋菌株可以與不含F(xiàn)因子的F－菌株接合，從而使后者也成為F＋菌株，其過(guò)程大體可分兩個(gè)階段：首先是F＋菌株與F－菌株配對(duì)，并通過(guò)性菌毛接合；然后F因子雙鏈DNA的一條單鏈在一特定的位置斷開(kāi)，通過(guò)性菌毛內(nèi)腔向F－菌株細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移，并同時(shí)在兩個(gè)菌株細(xì)胞內(nèi)以一條DNA單鏈為模板，各自復(fù)制合成完整的F因子。最初于1954年在大腸桿菌 K12中發(fā)現(xiàn)。 (1952年) 首先在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。轉(zhuǎn)化因子需具備兩個(gè)條件：較高的相對(duì)分子質(zhì)量和同源性。經(jīng)培養(yǎng)后，如發(fā)現(xiàn)某一營(yíng)養(yǎng)物的周?chē)猩L(zhǎng)圈，就說(shuō)明此菌就是該營(yíng)養(yǎng)物的缺陷型突變株。經(jīng)培養(yǎng)后，如果在完全培養(yǎng)基平板的某一部位上長(zhǎng)出菌落，而在基本培養(yǎng)基的相應(yīng)位置上卻不長(zhǎng)，說(shuō)明此乃營(yíng)養(yǎng)缺陷型。通過(guò)過(guò)濾就可除去大部分野生型，保留下?tīng)I(yíng)養(yǎng)缺陷型。第二步，淘汰野生型：在誘變后的存活個(gè)體中，營(yíng)養(yǎng)缺陷型的比例一般較低。初篩一般通過(guò)平板稀釋法獲得單個(gè)菌落，然后對(duì)各個(gè)菌落進(jìn)行有關(guān)性狀的初步測(cè)定，從中選出具有優(yōu)良性狀的菌落。劑量的選擇：劑量一般指強(qiáng)度與作用時(shí)間的乘積。要得到均勻分散的細(xì)胞懸液，可用無(wú)菌的玻璃珠來(lái)打散成團(tuán)的細(xì)胞，然后再用脫脂棉過(guò)濾。1943年，產(chǎn)黃青霉每毫升發(fā)酵液只產(chǎn)生約20單位的青霉素，通過(guò)誘變育種和其他措施配合，目前的發(fā)酵單位已比原來(lái)提高了三四十倍，達(dá)到了每毫升5萬(wàn)～10萬(wàn)單位。重組修復(fù)可以在不切除胸腺嘧啶二聚體的情況下，以帶有二聚體的這一單鏈為模板而合成互補(bǔ)單鏈，可是在每一個(gè)二聚體附近留下一個(gè)空隙。自發(fā)突變的可能機(jī)制：(1) 背景輻射和環(huán)境因素的誘變 (2) 微生物自身有害代謝產(chǎn)物的誘變 (3)由DNA復(fù)制過(guò)程中堿基配對(duì)錯(cuò)誤引起 ★3. 紫外線(xiàn)對(duì)DNA的損傷及其修復(fù)發(fā)現(xiàn)得較早和研究得較深入的是紫外線(xiàn)（UV）的作用。誘變作用是通過(guò)活細(xì)胞的代謝活動(dòng)摻入到DNA分子中而引起的，是間接的。 (四) 基因突變的機(jī)制1. 誘發(fā)突變概念：誘發(fā)突變簡(jiǎn)稱(chēng)誘變，是指通過(guò)人為的方法，利用物理、化學(xué)或生物因素顯著提高基因自發(fā)突變頻率的手段。2. 自發(fā)性在沒(méi)有人為誘發(fā)因素的情況下，各種遺傳性狀的改變可以自發(fā)地產(chǎn)生。(二) 突變率概念：某一細(xì)胞（或病毒顆粒）在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的概率，稱(chēng)突變率。廣泛應(yīng)用的一類(lèi)是溫度敏感突變型。廣義的突變包括染色體畸變和點(diǎn)突變?；蛑袛y帶的遺傳信息通過(guò)mRNA傳給蛋白質(zhì)。例如，真核微生物的中心體、線(xiàn)粒體、葉綠體等細(xì)胞器，還有2 μm質(zhì)粒。3個(gè)經(jīng)典實(shí)驗(yàn)的共同結(jié)論：只有核酸才是負(fù)載遺傳信息的真正物質(zhì)基礎(chǔ)。（三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)(1956年)進(jìn)一步用含RNA的煙草花葉病毒（TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn)。(1) 從活的S菌中抽提各種細(xì)胞成分（DNA、蛋白質(zhì)、莢膜多糖等）(2) 對(duì)各生化組分進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn) ①加S菌的DNA ②加S菌的DNA和DNA酶以外的酶 長(zhǎng)出S菌 ③加S菌的DNA和DNA酶活R菌 ④加S菌的RNA ⑤加S菌的蛋白質(zhì) 只長(zhǎng)R菌 ⑥加S菌的莢膜多糖結(jié)果只有S型菌株的DNA才能將肺炎鏈球菌的R型轉(zhuǎn)化為S型，而且DNA的純度越高，其轉(zhuǎn)化效率也越高，只取用6108g的純DNA時(shí)，仍保持轉(zhuǎn)化活力。變異的特點(diǎn)是在群體中以極低的概率(一般為105～1010)出現(xiàn)，性狀變