【正文】 我國菌種保藏多采用3種方法：斜面低溫保藏法、液氮超低溫保藏法和冷凍真空干燥保藏法。應(yīng)用時(shí)，可根據(jù)實(shí)際需要選用。（8）宿主保藏法適用于專性活細(xì)胞寄生微生物（如病毒、立克次氏體等）。從液氮罐中取出安瓿瓶時(shí)速度要快，一般不超過1min，以防其他安瓿瓶升溫而影響保藏質(zhì)量。缺點(diǎn)：需購置超低溫液氮設(shè)備，且液氮消耗較多，操作費(fèi)用較高。該法適用于各種微生物菌種的保藏（除少數(shù)對(duì)低溫?fù)p傷敏感的微生物外），藻類、原生動(dòng)物、支原體都能用此法保藏。不同微生物要選擇不同的保護(hù)劑，再通過試驗(yàn)加以確定保護(hù)劑的濃度，原則上是控制在不足以造成微生物致死的濃度。降溫的速度控制在(1～10)℃/min，細(xì)胞死亡率低；隨著速度加快，死亡率則相應(yīng)提高。美國ATCC菌種保藏中心把菌懸液或帶菌絲的瓊脂塊經(jīng)控制致冷速度，以每分鐘下降1℃/min 的速度從0℃直降到35℃，然后保藏在150℃～196℃液氮冷箱中。方法：以甘油、二甲基亞砜等作為保護(hù)劑，在液氮超低溫（196℃）下保藏的方法。缺點(diǎn)：操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機(jī)等設(shè)備。優(yōu)點(diǎn)：同時(shí)具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達(dá)5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。（6）冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。制作方法：將擬保藏菌種對(duì)數(shù)期的培養(yǎng)液直接與經(jīng)121℃蒸汽滅菌20min的甘油混合，并使甘油的終濃度在10％～15％，再分裝于小離心管中，置低溫冰箱中保藏。（5）甘油懸液保藏法方法：將菌種懸浮在甘油蒸餾水中，置于低溫下保藏。優(yōu)點(diǎn)：操作簡單，經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，工廠較多采用。將試管置于盛有氯化鈣等干燥劑的干燥器中，于室溫下干燥數(shù)日后移入低溫下保藏；干燥后也可將試管用火焰熔封，再保藏，則效果更好。（4）麩皮保藏法（曲法保藏）方法：以麩皮作載體，吸附接入的孢子，然后在低溫干燥條件下保存。它比石蠟油封藏法的保藏期長，約1～10年。需要保藏的菌株先用斜面培養(yǎng)基充分培養(yǎng)，再以無菌水制成108～1010個(gè)/ml菌懸液或孢子懸液滴入砂土管中，放線菌和霉菌也可直接刮下孢子與載體混勻，而后置于干燥器中抽真空約2～4h，用火焰熔封管口(或用石蠟封口)，置于干燥器中，在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏，后者效果更好。50℃烘干后經(jīng)檢查無誤后備用。（3）砂土管保藏法適用對(duì)象：適用于產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌及形成芽孢的細(xì)菌，對(duì)于一些對(duì)干燥敏感的細(xì)菌如奈氏球菌、弧菌和假單胞桿菌及酵母則不適用。但對(duì)很多厭氧性細(xì)菌的保藏效果較差，尤其不適用于某些能分解烴類的菌種。原理：由于液體石蠟阻隔了空氣，使菌體處于缺氧狀態(tài)下，而且又防止了水分揮發(fā)，使培養(yǎng)物不會(huì)干裂，因而能使保藏期達(dá)1～2年，或更長。（2）石蠟油封藏法方法：在無菌條件下，將滅過菌并已蒸發(fā)掉水分的液體石蠟倒入培養(yǎng)成熟的菌種斜面（或半固體穿刺培養(yǎng)物）上，石蠟油層高出斜面頂端lcm，使培養(yǎng)物與空氣隔絕，加膠塞并用固體石蠟封口后，垂直放在室溫或4℃冰箱內(nèi)保藏。優(yōu)點(diǎn)：簡便易行，容易推廣，存活率高，故科研和生產(chǎn)上對(duì)經(jīng)常使用的菌種大多采用這種保藏方法。這一改進(jìn)可使菌種的保藏期延長。放線菌、霉菌和有芽孢的細(xì)菌一般可保存6個(gè)月左右，無芽孢的細(xì)菌可保存1個(gè)月左右，酵母菌可保存3個(gè)月左右。幾種常用的菌種保藏方法：（1）斜面低溫保藏法方法：將菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，待菌種生長完全后，置于4℃左右的冰箱中保藏，每隔一定時(shí)間（保藏期）再轉(zhuǎn)接至新的斜面培養(yǎng)基上，生長后繼續(xù)保藏，如此連續(xù)不斷。用極低的溫度進(jìn)行保藏時(shí)效果更為理想，如液氮溫度(196℃)比干冰溫度(70℃)好，70℃又比20℃好，而20℃比4℃好。例如：酵母菌的冷凍速度以10℃/min為宜，而紅細(xì)胞則相應(yīng)地為20℃/min。當(dāng)從低溫下移出并開始升溫時(shí)，冰晶又會(huì)長大，此時(shí)快速升溫也可減少對(duì)細(xì)胞的損傷。原因：低溫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞膜的損傷。低溫必須與干燥結(jié)合，才具有良好的保藏效果。高度真空可以同時(shí)達(dá)到驅(qū)氧和深度干燥的雙重目的。干燥尤其是深度干燥，在菌種保藏中占有首要地位。其次，應(yīng)根據(jù)微生物生理、生化特點(diǎn)，人為地創(chuàng)造環(huán)境條件，使微生物長期處于代謝不活潑、生長繁殖受抑制的休眠狀態(tài)。三、菌種的保藏（一）、菌種保藏的目的盡可能保持優(yōu)良菌種原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達(dá)到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。3. 淘汰法將衰退菌種進(jìn)行一定的處理（如藥物，低溫、高溫等），可淘汰已衰退個(gè)體而達(dá)到復(fù)壯的目的。2. 宿主體內(nèi)復(fù)壯法對(duì)于寄生性微生物的衰退菌株，可通過接種到相應(yīng)昆蟲或動(dòng)植物宿主體內(nèi)來提高菌株的毒性。較精細(xì)的方法：有簡單的利用培養(yǎng)皿或凹玻片等作分離室的方法，也有利用復(fù)雜的顯微操縱器的純種分離方法。另一類是較精細(xì)的單細(xì)胞或單孢子分離方法。（二）菌種復(fù)壯的主要方法1. 純種分離法常用的分離純化的方法可歸納成兩類：一類較粗放，只能達(dá)到“菌落純”的水平，即從種的水平來說是純的。廣義的復(fù)壯：是指在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測定工作，以期從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。6. 定期進(jìn)行分離純化定期進(jìn)行分離純化，對(duì)相應(yīng)指標(biāo)進(jìn)行檢查，也是有效防止菌種衰退的方法。對(duì)于重要的菌種，盡可能采用多種保藏方法。在實(shí)踐中，用滅過菌的棉團(tuán)對(duì)放線菌進(jìn)行斜面移種，避免了菌絲的接入，達(dá)到了防止衰退的效果；有些霉菌（如構(gòu)巢曲霉）用分生孢子傳代易衰退，用子囊孢子移種能避免衰退。如培養(yǎng)營養(yǎng)缺陷型菌株時(shí)應(yīng)保證適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)成分，尤其是生長因子；培養(yǎng)一些抗性菌時(shí)應(yīng)添加一定濃度的藥物于培養(yǎng)基中,使回復(fù)的敏感型菌株的生長受到抑制，而生產(chǎn)菌能正常生長；控制好碳源、氮源等培養(yǎng)基成分和pH、溫度等培養(yǎng)條件，使之有利于正常菌株生長，限制退化菌株的數(shù)量，防止衰退。★（三）菌種衰退的防止1. 控制傳代次數(shù)盡量避免不必要的移種和傳代，將必要的傳代降低到最低限度，以減少自發(fā)突變的機(jī)率。一方面，傳代次數(shù)越多，發(fā)生自發(fā)突變（尤其是負(fù)突變）的幾率越高；另一方面，傳代次數(shù)越多，群體中個(gè)別的衰退型細(xì)胞數(shù)量增加并占據(jù)優(yōu)勢越快，致使群體表型出現(xiàn)衰退。由于自發(fā)突變或外界條件影響（如高溫），致使質(zhì)粒脫落，經(jīng)多次傳代后，就表現(xiàn)為衰退。（2）表型延遲造成菌種衰退在誘變育種過程中，經(jīng)常會(huì)發(fā)現(xiàn)某菌株初篩時(shí)產(chǎn)量較高，進(jìn)行復(fù)篩時(shí)產(chǎn)量卻下降了。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變，則表現(xiàn)為產(chǎn)量下降；如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變，則產(chǎn)生孢子的能力下降。開始在群體細(xì)胞中僅有個(gè)別細(xì)胞發(fā)生自發(fā)突變（一般均為負(fù)變），經(jīng)過連續(xù)傳代，群體中的負(fù)變個(gè)體達(dá)到一定數(shù)量，發(fā)展成為優(yōu)勢群體，從而使整個(gè)群體表現(xiàn)為嚴(yán)重的衰退。如抗噬菌體菌株變?yōu)槊舾芯甑?。如白僵菌?duì)宿主致病能力的降低等。3. 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力的下降，即出現(xiàn)負(fù)突變。一種微生物如果典型的形態(tài)特征逐漸減少，就表現(xiàn)為衰退。一、菌種的衰退（一）菌種衰退的現(xiàn)象概念：菌種衰退（degeneration）：是指由于自發(fā)突變的結(jié)果，而使某物種原有的一系列生物學(xué)性狀發(fā)生量變或質(zhì)變的現(xiàn)象。：干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營養(yǎng)、添加保護(hù)劑等。：純種分離法、宿主體內(nèi)復(fù)壯法、淘汰法和遺傳育種法。 “廣義的復(fù)壯”：在菌種的典型特征或生產(chǎn)性狀尚未衰退前，就經(jīng)常有意識(shí)地采取純種分離和生產(chǎn)性狀測定工作，從中選擇到自發(fā)的正突變個(gè)體。：控制傳代次數(shù)、創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件、利用不同類型的細(xì)胞移種傳代、采用有效的菌種保藏方法、講究菌種選育技術(shù)及定期進(jìn)行分離純化等?！锏诹?jié) 菌種的衰退、復(fù)壯和保藏重點(diǎn)：：菌種衰退的現(xiàn)象可表現(xiàn)在形態(tài)上或生理上。生物技術(shù)作為前途遠(yuǎn)大的高技術(shù)產(chǎn)業(yè)在世界范圍興起，生物工程將成為現(xiàn)代化的大工業(yè)，同時(shí)還極大地推動(dòng)了醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)科學(xué)的發(fā)展。基因工程的宿主細(xì)胞已從微生物發(fā)展到植物、動(dòng)物和人類細(xì)胞；基因工程的目的基因已經(jīng)從單個(gè)基因推廣到基因組，并從基因組學(xué)的高度解決目的基因的來源、定位和功能，形成了基因組工程新學(xué)科；人類基因組和植物、動(dòng)物、微生物基因組研究獲得的海量信息開始發(fā)展了后基因組工程，以便開發(fā)利用基因組學(xué)的巨大研究成果。今后，它必將對(duì)腫瘤的發(fā)生、細(xì)胞的分化和發(fā)育等重大生物學(xué)基本理論問題的解決做出新的貢獻(xiàn)。5. 基因工程與基本理論研究基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)生物學(xué)基本理論的研究起著巨大的推動(dòng)作用，尤其是為基因的結(jié)構(gòu)和功能的研究方面提供了極大的方便。另外，生物農(nóng)藥代替毒性大、對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重的化學(xué)農(nóng)藥是未來農(nóng)藥發(fā)展的方向。1降解芳烴、萜烴、多環(huán)芳烴 “超級(jí)菌”,它能把原油中約三分之二的烴消耗掉。目前尚無法治療的遺傳病、腫瘤、心腦血管疾病等可望通過基因工程得到治療。3. 基因工程在醫(yī)療上的應(yīng)用用正?；驈浹a(bǔ)有缺陷的基因，以治療某些遺傳性疾病，并可能治愈大多數(shù)遺傳性疾病。傳統(tǒng)工業(yè)發(fā)酵菌種的選育2. 基因工程在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用幾個(gè)主要的應(yīng)用領(lǐng)域包括:①將固氮菌的固氮基因轉(zhuǎn)移到生長在重要作物上的根際微生物或致瘤微生物中去,或?qū)⑺氲竭@類作物的細(xì)胞中,以獲得能獨(dú)立固氮的新型作物品種。在理想情況下，上述重組載體進(jìn)入受體細(xì)胞后，能通過自主復(fù)制而得到大量擴(kuò)增，從而使受體細(xì)胞表達(dá)出供體基因所提供的部分遺傳性狀，受體細(xì)胞就成了“工程菌”。受體細(xì)胞可以是微生物細(xì)胞，也可以是動(dòng)物或植物細(xì)胞。這時(shí)，在外加連接酶的作用下，供體的DNA片段與質(zhì)粒DNA片段的裂口處被“縫合”，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體。然后把兩者放在較低的溫度(5～6℃)下混合“退火”。真核細(xì)胞受體的載體主要有SV40病毒（動(dòng)物）和Ti質(zhì)粒（植物）。（二）選擇載體載體必須具備下列幾個(gè)條件：①是一個(gè)有自我復(fù)制能力的復(fù)制子；②能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，有較高的復(fù)制率；③載體上最好只有一個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體DNA的一定位置上；④載體上必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記，以便及時(shí)把極少數(shù)“工程菌”選擇出來。一、基因工程的基本操作基因工程的基本操作包括：目的基因的取得，載體系統(tǒng)的選擇，目的基因與載體重組體的構(gòu)建，重組載體導(dǎo)入受體細(xì)胞，“工程菌”或“工程細(xì)胞株”的表達(dá)、檢測以及實(shí)驗(yàn)室和一系列生產(chǎn)性試驗(yàn)等。第五節(jié) 基因工程概念：基因工程又稱遺傳工程，是指人們利用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，自覺設(shè)計(jì)、操縱、改造和重建細(xì)胞的基因組，從而使生物體的遺傳性狀發(fā)生定向變異，以最大限度地滿足人類活動(dòng)的需要。雙倍體雜合子性狀極不穩(wěn)定，在其進(jìn)行有絲分裂過程中，其中極少數(shù)核中的染色體會(huì)發(fā)生交換和單倍體化，從而形成了極個(gè)別具有新性狀的單倍體雜合子。某些