【正文】 ? 因重組形式 ? ? F＋ 、 F－ 、 Hfr和 F′菌株的異同，并圖示它們的相互關(guān)系。 ? 3個(gè)著名實(shí)驗(yàn)者選用了微生物作為研究對(duì)象 ? ? 存在方式。 三、菌種的保藏 ? 根據(jù)世界菌種保藏聯(lián)合會(huì)調(diào)查 ， 55個(gè)國家的菌種保藏機(jī)構(gòu)共有 352個(gè) ，許多大學(xué)及研究所都有自己的保藏機(jī)構(gòu)。經(jīng) 5年后，假定第1代 (原種 )的冷凍干燥保藏菌種已分發(fā)完畢，就再打開一瓶液氮保藏原種。 三、菌種保藏 ? ATCC僅采用兩種最有效的方法，即保藏期 5～ 15年的冷凍干燥保藏法和 20年以上的液氮保藏法，以最大限度地減少傳代次數(shù)和避免菌種衰退。 ? 西德“柯赫研究所” (RKI)。 ? 日本“大阪發(fā)酵研究所” (IFO)。 ? 美國“農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部菌種收藏所” (ARS)設(shè)立“北方地區(qū)研究室” (NRRL)。 ? 除了上述保藏中心外 ， 從事微生物研究并保藏有一定數(shù)量各類專業(yè)用微生物菌種的科研單位、大專院校還有近百所。 三、菌種保藏 抗菌素菌種保藏管理中心 (CACC)中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院抗菌素研究所，北京 (IA)； 四川抗菌素工業(yè)研究所，成都 (SIA)， 新抗菌素菌種；華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊 (IANP)， 生產(chǎn)用抗菌素菌種。 三、菌種保藏 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (ACCC) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京 (ISF)。 三、菌種保藏 ? （二）、國內(nèi)外菌種保藏部分情況： ? 我國 1979年 7月成立中國微生物菌種保藏管理委員會(huì) (CCCCM) ， 亞洲第一，有 14000余株各種微生物，三種保藏方法（斜面．凍干．液氮）下設(shè) 5個(gè)菌種保藏管理中心。 ? 真空冷凍干燥法 在低于 15℃ 下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后在真空中使水分升華致干。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。保藏期 1～ 10年。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。保藏時(shí)間一般不超過 3個(gè)月，到時(shí)必須進(jìn)行移接傳代，再放回冰箱。保持原種的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)考慮方法的通用性和簡便性。 ? （三）、淘汰衰退個(gè)體：例如對(duì) “ 5406” 放線菌的分生孢子 ， 采用 10～ 30℃ 5～ 7天 ， 死亡率達(dá)80%， 在抗低溫的存活個(gè)體中 ， 留下了未退化的健壯個(gè)體。稀釋、單細(xì)胞分離等。絲狀菌采用孢子移種避免菌絲傳代，交替使用分生孢子和子囊孢子傳代等也可防止退化。利用生產(chǎn)菌株的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型及抗性等，進(jìn)行生長譜平板檢查、藥物濃縮或抗性平板生長等也是純化的方法。 一、菌種退化及其防治 ? 菌種管理措施 定期針對(duì)性地進(jìn)行分離純化。如棲土曲霉 ，培養(yǎng)溫度由 28～ 30℃提高到 30 ～ 34℃ 防止了產(chǎn)孢子能力的衰退。保藏所用的斜面培養(yǎng)基組成應(yīng)根據(jù)不同菌種的特性加以選擇。斜面保藏于 4℃ 時(shí)，突變的可能性大，且斜面保藏一般每 3個(gè)月到半年需傳代 1次，對(duì)菌種不利。誘變處理后進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純粹，不再發(fā)生分離回復(fù)。泡盛曲霉變異菌株糖化酶產(chǎn)生株在馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上傳代酶產(chǎn)量降低極少，在麥汁酵母膏培養(yǎng)基上傳到第 10代，產(chǎn)酶能力降至 1/4。培養(yǎng)和保藏條件可以從多方面影響菌種的退化。 一、菌種退化及其防治 ? 非基因突變 。 一、菌種退化及其防治 ? （二）、菌種退化的原因： ? 基因（負(fù)）突變。由于雜菌污染導(dǎo)致生產(chǎn)性狀下降也不是退化，通過采取對(duì)設(shè)備的清洗、維修、重新殺菌等一系列措施，加強(qiáng)無菌操作，可以避免雜菌的繼續(xù)污染。不利環(huán)境往往加速突變型生產(chǎn)菌向野生型方向退化。自發(fā)變異的單個(gè)細(xì)胞與其它細(xì)胞一起接入新鮮培養(yǎng)基時(shí)，由于細(xì)胞生理、代謝調(diào)節(jié)及產(chǎn)生產(chǎn)物的不同，在某些培養(yǎng)條件下，發(fā)生自發(fā)變異退化細(xì)胞的數(shù)量可能逐漸增多，經(jīng)過多次傳代能使此變異類型完全占優(yōu)勢而導(dǎo)致細(xì)胞群體的退化。如產(chǎn)孢能力喪失、發(fā)酵液產(chǎn)物組成改變、主產(chǎn)物減少和副產(chǎn)物增加等。 ? 要使菌種在生產(chǎn)中長期保持優(yōu)良的生產(chǎn)性狀就必須設(shè)法減少菌種的退化和死亡，做好保藏工作。我國青霉素 G?；傅漠a(chǎn)量可達(dá) 3000單位 /L以上。目前美國已用基因工程菌生產(chǎn)。研究較多的是 α淀粉酶和青霉素?；?。經(jīng)過兩級(jí)克隆，麥迪霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生一種新的紫色化合物，是麥迪霉素與放線紫紅素的雜種化合物，為一種新的抗菌素 ,命名為 MederhodinA。蘇氨酸工程菌在前蘇聯(lián)和日本都已用于工業(yè)生產(chǎn) ,蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 60g/L以上，我國蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 20g/L 。 基因工程的主要操作步驟 二、基因工程在微生物方面的應(yīng)用 ? 提高代謝產(chǎn)物產(chǎn)量：例如所有的氨基酸合成酶基因都可以在不同系統(tǒng)中克隆與表達(dá)。 ? 以重組質(zhì)粒作載體 ,用轉(zhuǎn)化方法； 以病毒DNA作重組載體 ,用感染方法。使用最廣泛的是。由于每一種限制性內(nèi)切酶所切斷的雙鏈 DNA片段和粘性未端有相同的核苷酸組分，所以當(dāng)兩者相混時(shí)，凡粘性末端上堿基互補(bǔ)的片段，就會(huì)因氫鍵的作用而彼此吸引，重新形成雙鏈，這時(shí)，在外加連接酶的作用下，供體的 DNA片段與質(zhì)粒 DNA片段的裂口處被“縫合”，形成一個(gè)完整的有復(fù)制能力的環(huán)狀重組體 ——嵌合體。 一、基因工程的基本操作 ? （三）、目的基因與載體 DNA的體外重組：采用限制性內(nèi)切酶處理目的基因與載體 DNA， 獲得互補(bǔ)粘性末端或人工合成粘性末端。動(dòng)物細(xì)胞，主要是 SV40病毒。 一、基因工程的基本操作 ? （一）、目的基因的取得： ? ①選擇適宜的給體細(xì)胞，從中采集分離有生產(chǎn)意義的目的基因； ? ②通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用由 mRNA合成cDNA(互補(bǔ) DNA)； ? ③ 用化學(xué)方法合成特定功能的基因。 ? 基因工程屬于狹義的遺傳工程，習(xí)慣上所說的遺傳工程多指基因工程。 ? 以純齒棒桿菌 B9和天津短桿菌 TG866為親株進(jìn)行質(zhì)體融合，初篩后發(fā)現(xiàn) ，有的根本不產(chǎn)生谷氨酸，如 F F3 F220等；有的產(chǎn)率很低，如 F1 F26 F300等；有的產(chǎn)率介于兩親株之間，如 F70； 有的產(chǎn)率較兩親株都高，如 F26 F288等。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 篩選實(shí)用性菌株 融合子類型是各種各樣的，存在性能和產(chǎn)量不同的情況。因此，要獲得真正的融合子，必須在融合原生質(zhì)體再生后，進(jìn)行幾代自然分離和選擇，才能加以確定。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 選擇融合子 質(zhì)體融合可以是真正融合（雜合二倍體或單倍重組體）；或是暫時(shí)融合（異核體 ） 。菌種本身的再生特性、原生質(zhì)體制備條件、再生培養(yǎng)基成分及再生培養(yǎng)條件等影響再生。再生培養(yǎng)基必須加入具有一定滲透壓的基質(zhì)，成分因種而異。 Ca2*等強(qiáng)烈地促進(jìn)脂質(zhì)分子的擾動(dòng)和重新組合，使接觸處的膜形成小區(qū)域的融合，產(chǎn)生小的原生質(zhì)橋并逐漸增大，直至兩個(gè)原生質(zhì)體融合。 ? 研究發(fā)現(xiàn)，融合開始時(shí)，強(qiáng)烈脫水引起質(zhì)體粘合，不同程度地形成聚集場，質(zhì)體收縮并高度變形，大量粘著的質(zhì)體形成非常緊密的接觸。 ? 此外，破壁 pH值、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)方式、離 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 融合 ： 表面活性劑聚乙二醇 及 Ca2*、 Mg2*等陽離子 ， 使融合頻率出現(xiàn)突破性提高。細(xì)菌中多用蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等，酵母菌中多用山梨醇、甘露醇等，霉菌中多用 KCl和 NaCl等。過短，原生質(zhì)體形成不完全；過長，隨著酶解時(shí)間的延長，酶使膜損傷，原生質(zhì)體破裂、失活，再生率急劇降低。一般酶解溫度 20～ 40 ℃ 。最適溫度是兩種效應(yīng)的共同結(jié)果。最佳酶濃度是使形成率和再生率之積達(dá)到最大。細(xì)菌采用對(duì)數(shù)生長后期，放線菌采用對(duì)數(shù)生長期到平衡期之間的轉(zhuǎn)換期最為合適。在細(xì)菌中加入 EDTA、 甘氨酸、青霉素和 D環(huán)絲氨酸等；在放線菌的中加入 1%～ 4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入EDTA和巰基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入 2脫氧葡萄糖等。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 制備原生質(zhì)體 細(xì)菌和放線菌主要采用溶菌酶；酵母菌和霉菌可用蝸牛酶和纖維素酶。最好選擇對(duì)菌株生產(chǎn)性能沒有影響的標(biāo)記。已知融合頻率較高時(shí)，為了減少標(biāo)記對(duì)正常代謝的干擾，可以僅有一個(gè)標(biāo)記。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 篩選標(biāo)記菌株 親株常采用常規(guī)誘變育種方法，獲得營養(yǎng)缺陷和抗藥性等遺傳性狀為標(biāo)記。 誘變因子的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng) 單獨(dú)處理 復(fù)合處理 菌種 誘變劑 突變率 (%) 誘變劑 突變率 (%) 土曲霉 紫外線 X 射線 1 X 射線 + 紫外線 土曲霉 氮芥 (%) 紫外線 不明顯 氮芥 + 紫外線 鏈霉菌 紫外線 γ 射線 紫外線 + γ 射線 金色鏈霉菌 (2U 84) 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外線 二乙稀三胺 + 紫外線 硫酸二乙酯 + 紫外線 灰色鏈霉菌 (JIC 1) 紫外線 紫外線 + 可見光照射 1 次 紫外線 + 可見光照射 6 次 二、原生質(zhì)體融合育種 ? （一）基本原理 ： 將兩個(gè)親株細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以剝除，在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體；將兩個(gè)親株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇(PEG)等助融，使細(xì)胞質(zhì)融合；通過兩套基因組之間的接觸、交換，發(fā)生基因組的遺傳重組，在再生細(xì)胞中獲得重組體。 一、突變與育種 ? 誘變劑的復(fù)合處理常呈現(xiàn)一定的協(xié)同效應(yīng)。 ? 正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，負(fù)變則相反；經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株，更容易出現(xiàn)負(fù)變。凡在高誘變率的基礎(chǔ)上既能擴(kuò)大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量 。 ? 物理誘變劑劑量：強(qiáng)度時(shí)間，紫外線強(qiáng)度單位是爾格， X射線單位是倫琴或拉得等；化學(xué)誘變劑劑量：一定溫度下誘變劑濃度和處理時(shí)間。如紫外線、 X射線、 γ射線和快中子等；烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物。 ? 誘變霉菌或放線菌稍加萌發(fā)的孢子；芽孢桿菌的芽孢 (只有一個(gè)核質(zhì)體 )；細(xì)菌對(duì)數(shù)期誘變處理效果較好。只有經(jīng)過 DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，表型才會(huì)發(fā)生變異，出現(xiàn)不純菌落，稱為“表型延遲”。 一、突變與育種 ? 誘變育種必須使用均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。 一、突變與育種 ? 誘變育種的基本結(jié)果：以高產(chǎn)突變株為例 ? 誘變 出發(fā)菌株－－ {絕大多數(shù)死亡 少數(shù)存活 {多數(shù)未變 多數(shù)負(fù)變 少數(shù)突變 {少數(shù)正變少數(shù)正變 {多數(shù)幅度小 少數(shù)幅度大 {多數(shù)不宜投產(chǎn) ? 少數(shù)適宜投產(chǎn) 一、突變與育種 ? 誘變育種的基本路線： ? 確定出發(fā)菌株 → 純化選優(yōu) → 性能測定 →同步培養(yǎng) → 制備單細(xì)胞（單孢子）懸液→ 活菌濃度測定 → 誘變劑選擇與劑量確定預(yù)試驗(yàn) → 誘變處理 → 平板分離 → 計(jì)數(shù)（變異菌落與突變率） → 挑取疑似菌落純培養(yǎng) →