【正文】 噬菌體裂解第一個宿主 一個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子的形成 1. 第一次交換 2. 第二次交換 3. 交換完成，外源 DNA摻入染色體組中 ? 流 產(chǎn) 普 遍 性 轉(zhuǎn) 導(dǎo) （ abortive transduction） ? 概念： 受體菌經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)獲得的供體 DNA片段在受體菌中不發(fā)生配對、交換和整合，也不迅速消失，而只是進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)譯（性狀表達(dá)），這種現(xiàn)象就稱為 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 由于超 、 不能產(chǎn)生子代噬菌體的裂解 ， 稱為 自外裂解 （ lysis from without） 。 感染復(fù)數(shù)（ ， multiplicity of infection） : 感染復(fù)數(shù) ——由于每一宿主細(xì)胞表面的特異性受體有限 ，因此所能吸附的噬菌體數(shù)目也有一個限量 。 ?供體菌裂解時，如把少量裂解物與大量受體菌群體相混， 使其 感染復(fù)數(shù)（ ） 1， 這種完全缺陷噬菌體就會將這一外源 DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)。 1952 年 發(fā) 現(xiàn) ， 在Salmonella typhimurium中存在轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象 。 完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo) 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 過程： 供體菌 正常噬菌體 + 完全缺陷噬菌體 少量裂解物 + 大量受體菌 遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子 （ 1 ） 普 遍 性 轉(zhuǎn) 導(dǎo) （ generalized transduction） ? 定義： 通過 完全缺陷噬菌體 對供體菌任何DNA小片段的 “ 誤包 ” 而實現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象 ， 稱為 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 A B [] [] Try+his+ Tryhis+ Try+his 定義： 以溫和 噬菌體為媒介，將供體細(xì)胞的 DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)。 可轉(zhuǎn)化的形狀： 莢膜多糖的合成 專一性酶的合成 專一性蛋白質(zhì)的合成 抗藥性 （ transfection） ? 定義： – 把噬菌體或其它病毒的 DNA（或 RNA）抽提出來，讓它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)染（ transfection）。 自然轉(zhuǎn)化的普遍性： 人工轉(zhuǎn)化 人工轉(zhuǎn)化 ——是通過人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取 DNA的能力，或人工地將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 – 兩個菌種或菌株之間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，與它們在進(jìn)化過程中的親緣關(guān)系有著密切的關(guān)系。如果用 CaCl2處理 E. coli的球狀體，就可以使之發(fā)生低頻率的轉(zhuǎn)化。 – 在若干放線菌和藍(lán)細(xì)菌以及 Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa（粗糙脈胞菌）和 Aspergillus niger中，也有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。在這一過程中，有核酸酶、 DNA聚合酶和 DNA連接酶的參與； – 復(fù)制 ：受體菌的染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一獲得了供體菌的轉(zhuǎn)化基因，另一個未獲供體基因； – 轉(zhuǎn)化子形成 ：當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂后，一個子細(xì)胞含供體基因，這就是轉(zhuǎn)化子；另一個細(xì)胞與原始受體菌一樣。分子量小于 5 105的DNA片段不能進(jìn)入細(xì)胞。在吸附過程的前階段，如外界加入 DNA酶，就會減少轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式 （雙鏈閉合環(huán)狀）的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高（因為它進(jìn)入受體菌中后，可不必與受體染色體進(jìn)行交換、整合即可進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)）；。 – 吸收數(shù)量：每個感受態(tài)細(xì)胞約可摻入 10個轉(zhuǎn)化因子。 – 大?。航?jīng)過多次提純操作后，每一轉(zhuǎn)化 DNA片段的分子量都小于 1 107，即約占細(xì)菌核染色體組的 %，其上平均約含 15個基因。 S. Pneumonia的感受態(tài)細(xì)胞中提取的感受態(tài)因子可使同菌株的非感受態(tài)細(xì)胞變成感受態(tài)的 ， 而 Bacillus subtilis的感受態(tài)因子則無此功能 。 對不同細(xì)菌 ， 每個細(xì)胞上的 DNA結(jié)合位點數(shù)不同 。如用 CaCl2 處理 E. coli可以誘發(fā)其產(chǎn)生感受態(tài)。 ?有關(guān)名詞： ?受體菌： recipient/receptor，轉(zhuǎn)化基因的接受者 ?供體菌： donor，轉(zhuǎn)化基因的提供者 ?轉(zhuǎn)化因子： 來自供體菌的 DNA片段 ?轉(zhuǎn)化子 ： transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進(jìn)入自身染色體組的重組子 （一）轉(zhuǎn)化（ transformation） 轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn)： ① 受體細(xì)胞要處于感受態(tài) . ?感受態(tài) ： petence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源 DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài) ②供體 DNA片段（ 轉(zhuǎn)化因子 ） 大小適宜，分子量一般為 1 107 D 左右 ③菌株間的親緣關(guān)系密切 轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件： 轉(zhuǎn)化的類型： 根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為： ①自然遺傳轉(zhuǎn)化 natural geic transformation ② 人工轉(zhuǎn)化 artificial transformation 感受態(tài)： ? 出現(xiàn)時間： 只在細(xì)菌生長的某一時期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長時期 – Streptococcus pneumoniae的感受態(tài)出現(xiàn)在生長曲線中的指數(shù)期的中期， – Bacillus的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。 甲 生長快、產(chǎn)量低 乙 生長慢、產(chǎn)量高 基因重組 如： 生長快、產(chǎn)量高 一 、 原核微生物的基因重組 ? 基因重組的方式 – 轉(zhuǎn)化 – 轉(zhuǎn)導(dǎo) – 接合 – 原生質(zhì)體融合 R型活菌 +S型死菌 → →S型活菌 ?定義： 受體菌自然或在人工技術(shù)作用下直接攝取來自供體菌的游離 DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過程，稱為轉(zhuǎn)化。 ? ②利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過長期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。 基因重組的意義 ? 基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。 – 真核微生物中的有性雜交、準(zhǔn)性雜交（ parasexual hybridization）等及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映。 ? 作用：重組可使生物體在未發(fā)生突變的情況下，也能產(chǎn)生新遺傳型的個體。 Ames test：對化學(xué)誘變劑做檢測 菌種：鼠傷寒沙門氏菌 his ； 原理： his 在基本培養(yǎng)基上不長；而發(fā)生回復(fù)突變則長。 ① 逐個檢出法： 缺陷 型 的檢出： ② 影印平板培養(yǎng)法 ③ 夾層培養(yǎng)法 ① 生長譜法 ? 方法簡便； ? 回變和污染不影響 結(jié)果 ? 測定物質(zhì)可為粉末 或紙片 缺陷型 的鑒定 ： 測定一般應(yīng)分兩階段： ? 第一階段：測定是哪類物質(zhì)的缺陷型； ? 第二節(jié)段：根據(jù)第一階段確定的范圍 ， 進(jìn)一步確定是哪種具體化合物的 缺陷 型； 組合營養(yǎng)物法： 步驟（以氨基酸缺陷型的鑒定為例）： a. 將多種營養(yǎng)因子編組； b. 將組合液的紙片放在涂菌的基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)； c. 結(jié)果分析； 如： 一組： 1 2 3 4 5 二組： 2 6 7 8 9 三組： 3 7 10 11 12 四組： 4 8 11 13 14 五組： 5 9 12 14 15 營養(yǎng)因子分組編排時注意； 1）每組內(nèi)無重復(fù)的營 養(yǎng)因子 2）每組中應(yīng)包含只出 現(xiàn)一次的因子 3）每組中其他因子應(yīng) 分別出現(xiàn)二次 一組： 1 2 3 4 5 二組： 2 6 7 8 9 三組： 3 7 10 11 12 四組： 4 8 11 13 14 五組： 5 9 12 14 15 ② 組合補充培養(yǎng)基法： –將待測的菌點種到各種補充培養(yǎng)基上，逐個分析各菌的缺陷 類型，或快速分離出所需 缺陷 類型的菌株。 ★ 營養(yǎng)缺陷型誘變篩選步驟及方法 auxo的鑒定 誘變處理 auxo的濃縮 auxo的檢出 缺陷 型 的濃縮： ① 抗生素法 原理： 青霉素 、 制霉菌素等抗生素作用于生長著的微生物細(xì)胞 ， 對休止態(tài)細(xì)胞無作用 。 完全培養(yǎng)基 （ CM） [+]：滿足一切 營養(yǎng)缺陷 型 菌株 生長的天然或半 合成 培養(yǎng)基。 原養(yǎng)型 ： 指營養(yǎng)缺陷型突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。 如： lys + 。 方法：梯度平板法（ gradient plate） 抗藥性突變株的應(yīng)用： ?作為菌株的遺傳標(biāo)記 ?作為生產(chǎn)菌種（結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株） ： ★ 與營養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個體： 營養(yǎng)缺陷型 ： 經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長的變異菌株。 舉例： ?由谷氨酸產(chǎn)生菌乳糖發(fā)酵短桿菌 2256，經(jīng)誘變處理得到溫度敏感變異株 Ts88: ?30℃ 培養(yǎng)時能正常生長 ?40℃ 是死亡，但能在富含生物素的培養(yǎng)基中積累谷氨酸（而野生型卻受生物素的反饋抑制）。 篩選是 最為艱難的也是最為重要 的步驟 . 可見，設(shè)計和采用效率高的篩選方案和方法極其重要。 ? 初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)； ——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應(yīng)盡可能快速、簡單。 一種較有效的簡易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞 ， 然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒 （ 也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片 ） ， 經(jīng)培養(yǎng)后 ， 在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落 ， 分別制成懸浮液 ， 然后將其涂在一般平板表面使長出許多單菌落 ， 最后可用影印培養(yǎng)法或逐個檢出法選出突變種 。 ? 簡便有效的誘變方法： 紫外線的照射最為方便 。 最適劑量的選擇 ：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在 70~80%） ? 選擇誘變劑的種類 ：在選用理化因子作誘變劑時 ， 在同樣效果下 ， 應(yīng)選用 最方便 的因素；而在同樣方便的情況下 ，則應(yīng)選擇 最高效 的因素 。 產(chǎn)生原因： ①分離性遲延現(xiàn)象 ②生理性遲延現(xiàn)象 ： 誘變劑的作用： ①提高突變的頻率 ②擴(kuò)大產(chǎn)量變異的幅度 ③使產(chǎn)量變異朝著正突變或負(fù)突變移動 劑量的表示法 ：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應(yīng)預(yù)先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。 ② 加０ .3%吐溫 80（表面活性劑） ③用無菌脫脂棉過濾。 （七）誘變育種 誘變 育種的步驟 ： 原始菌種 純化 斜面 /肉湯培養(yǎng) 單孢子 /單細(xì)胞懸液 誘變劑處理 平板分離 移至斜面 小試 中試 初篩 復(fù)篩 計算存活率 觀察形態(tài)變異，挑單菌落 良種保藏 原菌種特性鑒定 誘變育種的基本過程： 選擇選擇合適的出發(fā)菌株 ↓ 制備待處理的菌懸液 ↓ 誘變處理 ↓ 篩選 ↓ 保藏和擴(kuò)大試驗 ： 出發(fā)菌株 ———用來 育種處理的 起始菌株 ◆ 出發(fā)菌株應(yīng)具備： ①對誘變劑的敏感性高； ② 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； ◆ 出發(fā)菌株的來源； ①自然界直接分離到的野生型菌株： ②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株： ③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株： 要求： ①菌體處于對數(shù)生長期，并使細(xì)胞處于同步生長； ②細(xì)胞分散且為單細(xì)胞，以避免 表型遲延現(xiàn)象（ phenotypic lag） 。 ? 誘變育種具有極其重要的實踐意義 。 生產(chǎn)上經(jīng)常采用的劑量：