【正文】 hybridization）等及原核生物中的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和原生質(zhì)體融合等都是基因重組在細(xì)胞水平上的反映。 微生物中各種形式基因重組的比較 ? 重組范圍 整套染色體 局部雜合 ? 供體和受體的關(guān)系 高頻率 低頻率 部分染色體 個(gè)別或少數(shù)基因 ? 細(xì)胞融合 性細(xì)胞 真菌的有性生殖 ? 或聯(lián)結(jié) 體細(xì)胞 真菌的準(zhǔn)性生殖 ? 細(xì)胞間暫時(shí)溝通 細(xì)菌的接合 性導(dǎo) ? 細(xì)胞間 吸收游離 DNA片段 轉(zhuǎn)化 ? 不接觸 噬菌體攜帶 DNA 轉(zhuǎn)導(dǎo) ? 噬菌體 完整噬菌體 溶源轉(zhuǎn)變 ? 提供遺 噬菌體 DNA 轉(zhuǎn)染 ? 傳物質(zhì) 基因重組的意義 ? 基因重組是雜交育種的理論基礎(chǔ)。 ? 雜交育種的優(yōu)點(diǎn)： ①由于雜交育種選用了已知性狀的供體菌和受體菌作為親本，因此，不論在方向性還是自覺(jué)性方面，均比誘變育種前進(jìn)了一大步。 ? ②利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。 ? 雜交育種的缺點(diǎn)： 由于雜交育種的方法較復(fù)雜，工作進(jìn)展較慢，還很難像誘變育種技術(shù)那樣得到普遍的推廣和使用，尤其在原核生物的領(lǐng)域中，應(yīng)用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合等重組技術(shù)來(lái)培育可應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐上的高產(chǎn)菌株的例子還不多見(jiàn)。到了70年代后期，由于原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得巨大的成功后，才使重組育種技術(shù)獲得了飛速的發(fā)展。 甲 生長(zhǎng)快、產(chǎn)量低 乙 生長(zhǎng)慢、產(chǎn)量高 基因重組 如： 生長(zhǎng)快、產(chǎn)量高 一 、 原核微生物的基因重組 ? 基因重組的方式 – 轉(zhuǎn)化 – 轉(zhuǎn)導(dǎo) – 接合 – 原生質(zhì)體融合 R型活菌 +S型死菌 → →S型活菌 ?定義： 受體菌自然或在人工技術(shù)作用下直接攝取來(lái)自供體菌的游離 DNA片段，并把它整合到自己的基因組中，而獲得部分新的遺傳性狀的基因轉(zhuǎn)移過(guò)程，稱(chēng)為轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱(chēng)為 轉(zhuǎn)化子（ transformant）。 ?有關(guān)名詞： ?受體菌： recipient/receptor，轉(zhuǎn)化基因的接受者 ?供體菌： donor，轉(zhuǎn)化基因的提供者 ?轉(zhuǎn)化因子： 來(lái)自供體菌的 DNA片段 ?轉(zhuǎn)化子 ： transformant，將轉(zhuǎn)化基因重組進(jìn)入自身染色體組的重組子 （一）轉(zhuǎn)化（ transformation） 轉(zhuǎn)化及其發(fā)現(xiàn)： ① 受體細(xì)胞要處于感受態(tài) . ?感受態(tài) ： petence，受體細(xì)胞能從環(huán)境吸取外源 DNA片段并實(shí)現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài) ②供體 DNA片段（ 轉(zhuǎn)化因子 ） 大小適宜，分子量一般為 1 107 D 左右 ③菌株間的親緣關(guān)系密切 轉(zhuǎn)化發(fā)生的條件： 轉(zhuǎn)化的類(lèi)型： 根據(jù)感受態(tài)建立的方式，可以分為： ①自然遺傳轉(zhuǎn)化 natural geic transformation ② 人工轉(zhuǎn)化 artificial transformation 感受態(tài)： ? 出現(xiàn)時(shí)間： 只在細(xì)菌生長(zhǎng)的某一時(shí)期出現(xiàn)；不同菌種的感受態(tài)出現(xiàn)在不同生長(zhǎng)時(shí)期 – Streptococcus pneumoniae的感受態(tài)出現(xiàn)在生長(zhǎng)曲線中的指數(shù)期的中期， – Bacillus的一些種則往往出現(xiàn)在指數(shù)期末及穩(wěn)定期的初期。 – 感受態(tài)由細(xì)胞的遺傳性決定，但同時(shí)也受環(huán)境因子的影響： cAMP、 Ca2+等最明顯。如用 CaCl2 處理 E. coli可以誘發(fā)其產(chǎn)生感受態(tài)。 ? 感受態(tài)細(xì)胞的比例： 當(dāng)處于感受態(tài)高峰時(shí)，群體中呈感受態(tài)的細(xì)胞因菌種而不同 . – Bacillus subtilis不超過(guò) 10~15% – Streptococcus pneumonia和 Haemophilus influenzae（流感嗜血桿菌）達(dá)到 100% ? 轉(zhuǎn)化 DNA的最低濃度： 在群體中含有 15%感受態(tài)細(xì)胞時(shí)， ?gDNA/ml細(xì)胞懸液即可有效發(fā)生轉(zhuǎn)化 感 受 態(tài) 因 子 ： 細(xì) 胞 外 蛋 白 ， Streptococcus pneumonia 和 Bacillus 中 分 離 的 分 子 量 為5,000~10,000Dalton， 可能存在于細(xì)胞膜上 ， 可催化外來(lái) DNA分子的吸收或降解細(xì)胞表面某種成分 ， 以讓細(xì)胞表面的 DNA受體顯露出來(lái)；也可能是一種自溶酶 。 對(duì)不同細(xì)菌 ， 每個(gè)細(xì)胞上的 DNA結(jié)合位點(diǎn)數(shù)不同 。 有人計(jì)算 ， 在 H. Influenzae上有 4~10個(gè) ， 而在S. Pneumonia上則有 30~80個(gè) 。 S. Pneumonia的感受態(tài)細(xì)胞中提取的感受態(tài)因子可使同菌株的非感受態(tài)細(xì)胞變成感受態(tài)的 ， 而 Bacillus subtilis的感受態(tài)因子則無(wú)此功能 。 轉(zhuǎn)化因子： ? 轉(zhuǎn)化因子：本質(zhì)是供體 DNA片段 – 一般的轉(zhuǎn)化因子都是線狀雙鏈 DNA；也有少數(shù)報(bào)道認(rèn)為線狀單鏈 DNA也有轉(zhuǎn)化作用。 – 大?。航?jīng)過(guò)多次提純操作后，每一轉(zhuǎn)化 DNA片段的分子量都小于 1 107，即約占細(xì)菌核染色體組的 %，其上平均約含 15個(gè)基因。而粗制的 DNA則分子量較大。 – 吸收數(shù)量：每個(gè)感受態(tài)細(xì)胞約可摻入 10個(gè)轉(zhuǎn)化因子。 – 轉(zhuǎn)化頻率： 一般只有 ~1%，最高時(shí)亦達(dá)10%左右。據(jù)研究，呈質(zhì)粒形式 （雙鏈閉合環(huán)狀）的轉(zhuǎn)化因子，其轉(zhuǎn)化頻率最高（因?yàn)樗M(jìn)入受體菌中后，可不必與受體染色體進(jìn)行交換、整合即可進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)）；。 自然轉(zhuǎn)化 . 轉(zhuǎn)化的過(guò)程 ? 以 S. Pneumonia strr（肺炎鏈球菌抗鏈霉素菌株）為例，大致可分為六階段： – 吸附 ：雙鏈 DNA片段與細(xì)胞表面的特定位點(diǎn)（主要在新形成細(xì)胞壁的赤道區(qū)）結(jié)合，此時(shí)，細(xì)胞膜上的膽堿可促進(jìn)這一過(guò)程。在吸附過(guò)程的前階段，如外界加入 DNA酶，就會(huì)減少轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)生。稍后，DNA酶即無(wú)影響，說(shuō)明此時(shí)該轉(zhuǎn)化因子已進(jìn)入細(xì)胞； – 切割 ：在吸附位點(diǎn)上的 DNA被核酸內(nèi)切酶分解，形成平均分子量為4~5 106的 DNA片段； – 入胞 ： DNA雙鏈中的一條單鏈被膜上的另一種核酸酶切除，另一條單鏈逐步進(jìn)入細(xì)胞，這是一個(gè)耗能的過(guò)程。分子量小于 5 105的DNA片段不能進(jìn)入細(xì)胞。這時(shí)如用低濃度溶菌酶處理，因它提高了細(xì)胞壁的通透性，故可提高轉(zhuǎn)化頻率； – 重組 ：來(lái)自供體菌的單鏈 DNA片段在細(xì)胞內(nèi)與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)配對(duì)，接著受體染色體組上的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來(lái)的單鏈 DNA交換、整合和取代，于是形成了一個(gè)雜合 DNA區(qū)段（ heterozygous region）。在這一過(guò)程中，有核酸酶、 DNA聚合酶和 DNA連接酶的參與； – 復(fù)制 ：受體菌的染色體組進(jìn)行復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個(gè)，其中之一獲得了供體菌的轉(zhuǎn)化基因，另一個(gè)未獲供體基因； – 轉(zhuǎn)化子形成 ：當(dāng)細(xì)胞發(fā)生分裂后，一個(gè)子細(xì)胞含供體基因，這就是轉(zhuǎn)化子；另一個(gè)細(xì)胞與原始受體菌一樣。 降解 吸附 切割成 4~5 106 單鏈入胞 同源部分配對(duì)、整合 復(fù)制分裂，只有一個(gè)子代DNA分子獲得供體基因 非轉(zhuǎn)化子 轉(zhuǎn)化子 轉(zhuǎn)化的過(guò)程 strr strr ? 到目前為止，已發(fā)現(xiàn)能發(fā)生轉(zhuǎn)化作用的菌屬主要有： – Streptococcus pneumoniae、 Haemophilus（嗜血桿菌屬）、 Bacillus、 Neisseria（奈瑟氏球菌屬）、Rhizobium（根瘤菌屬）、 Staphylococcus、Pseudomonas和 Xanthomonas中多見(jiàn)。 – 在若干放線菌和藍(lán)細(xì)菌以及 Saccharomyces cerevisiae、Neurospora crassa（粗糙脈胞菌）和 Aspergillus niger中，也有轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。 – 腸桿菌科的一些細(xì)菌很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化，主要原因一方面由于外來(lái) DNA難以摻入到細(xì)胞中，另一方面在受體細(xì)胞內(nèi)常存在可降解線形 DNA的核酸酶。如果用 CaCl2處理 E. coli的球狀體，就可以使之發(fā)生低頻率的轉(zhuǎn)化。另外，可利用霉菌的原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化。 – 兩個(gè)菌種或菌株之間能否發(fā)生轉(zhuǎn)化，與它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中的親緣關(guān)系有著密切的關(guān)系。但即使在轉(zhuǎn)化率極高的菌種中，其不同菌株間也不一定都能發(fā)生轉(zhuǎn)化。 自然轉(zhuǎn)化的普遍性： 人工轉(zhuǎn)化 人工轉(zhuǎn)化 ——是通過(guò)人為誘導(dǎo)的方法，使細(xì)胞具有攝取 DNA的能力，或人工地將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 方法： ① CaCl2處理 細(xì)胞，使其成為能攝取外源 DNA的感受態(tài)狀態(tài) . ② 電穿孔法 electroporation：用高壓脈沖電流擊破細(xì)胞膜，或擊成小孔，使各種大分子（包括 DNA ）能通過(guò)這些小孔進(jìn)入細(xì)胞。 可轉(zhuǎn)化的形狀： 莢膜多糖的合成 專(zhuān)一性酶的合成 專(zhuān)一性蛋白質(zhì)的合成 抗藥性 （ transfection） ? 定義： – 把噬菌體或其它病毒的 DNA（或 RNA）抽提出來(lái)，讓它去感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，并進(jìn)而產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒的后代，這種現(xiàn)象稱(chēng)為轉(zhuǎn)染（ transfection）。 ? 與轉(zhuǎn)化的區(qū)別： – 病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌 – 中間不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合 – 最后不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子 [] [] [] Tryhis+ Try+his Try+his+ 混合培養(yǎng) A B 三、轉(zhuǎn)導(dǎo)（ transduction） （ 1952）在 Salmonella typhimurium（鼠傷寒沙門(mén)氏菌）中發(fā)現(xiàn)的。 A B [] [] Try+his+ Tryhis+ Try+his 定義： 以溫和 噬菌體為媒介，將供體細(xì)胞的 DNA片段攜帶到受體細(xì)胞中，通過(guò)交換與整合，從而使后者獲得前者部分遺傳性狀的現(xiàn)象，稱(chēng)為轉(zhuǎn)導(dǎo)。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，稱(chēng)轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) 轉(zhuǎn)導(dǎo) 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 局限轉(zhuǎn)導(dǎo) 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) 過(guò)程： 供體菌 正常噬菌體 + 完全缺陷噬菌體 少量裂解物 + 大量受體菌 遺傳穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子 （ 1 ） 普 遍 性 轉(zhuǎn) 導(dǎo) （ generalized transduction） ? 定義： 通過(guò) 完全缺陷噬菌體 對(duì)供體菌任何DNA小片段的 “ 誤包 ” 而實(shí)現(xiàn)其遺傳性狀傳遞至受體菌的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象 ， 稱(chēng)為 普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo) 。 ? (普遍性 )轉(zhuǎn)導(dǎo)： plete transduction 。 1952 年 發(fā) 現(xiàn) ， 在Salmonella typhimurium中存在轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象 。在它的完全普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中： ? 以其野生型菌株作為供體菌 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株作為受體菌 ? P22噬菌體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介 ， 對(duì)供體菌是烈性噬菌體 ， 對(duì)受體菌是溫和噬菌體 裂解 完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo) （ 1 ） 普 遍 性 轉(zhuǎn) 導(dǎo) （ generalized transduction） 過(guò)程： ? P22在供體菌內(nèi)增殖時(shí)，宿主的核染色體組斷裂，待噬菌體成熟與包裝之際，極少數(shù)（ 10 – 6 ~10 – 8）噬菌體的衣殼將與噬菌體頭部核心大小相似的一段供體 DNA片段誤包入其中，形成了一個(gè)完全不含噬菌體自身 DNA的缺陷噬菌體。 ?供體菌裂解時(shí)，如把少量裂解物與大量受體菌群體相混， 使其 感染復(fù)數(shù)（ ） 1， 這種完全缺陷噬菌體就會(huì)將這一外源 DNA片段導(dǎo)入受體細(xì)胞內(nèi)。 ?在這種情況下，由于一個(gè)受體細(xì)胞只感染了一個(gè)完全缺陷噬菌體，故受體細(xì)胞不會(huì)發(fā)生往常的溶原化，也不顯示其免疫性，更不會(huì)裂解和產(chǎn)生正常的噬菌體；而由于導(dǎo)入的外源 DNA片段可與受體細(xì)胞核染色體組上的同源區(qū)段配對(duì)，在通過(guò)雙交換而整合到受體菌染色體組中，所以使后者成為一個(gè) 遺傳性狀穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子。 感染復(fù)數(shù)（ ， multiplicity of infection） : 感染復(fù)數(shù) ——由于每一宿主細(xì)胞表面的特異性受體有限 ，因此所能吸附的噬菌體數(shù)目也有一個(gè)限量 。 每一敏感細(xì)胞所能吸附的噬菌體的數(shù)量 , ， 可達(dá) 250~360。 由于超 、 不能產(chǎn)生子代噬菌體的裂解 ， 稱(chēng)為 自外裂解 （ lysis from without） 。 噬菌體裂解第一個(gè)宿主時(shí)可能有三種情況： 1）包入的完全是噬菌體的 DNA（ 正常噬菌體 ） 2）包入的完全是細(xì)菌 DNA（ 完全缺陷