【正文】 ， 以讓細(xì)胞表面的 DNA受體顯露出來；也可能是一種自溶酶 。轉(zhuǎn)化后的的受體菌稱為 轉(zhuǎn)化子（ transformant）。 ? ②利用雜交育種往往還可以消除某一菌株在經(jīng)過長(zhǎng)期誘變處理后所出現(xiàn)的產(chǎn)量上升緩慢的現(xiàn)象，因此，它是一種重要的育種手段。 – 雜交中必然包含著重組，而重組則不限于雜交這一形式。 Ames test：對(duì)化學(xué)誘變劑做檢測(cè) 菌種：鼠傷寒沙門氏菌 his ； 原理： his 在基本培養(yǎng)基上不長(zhǎng)；而發(fā)生回復(fù)突變則長(zhǎng)。 ★ 營(yíng)養(yǎng)缺陷型誘變篩選步驟及方法 auxo的鑒定 誘變處理 auxo的濃縮 auxo的檢出 缺陷 型 的濃縮： ① 抗生素法 原理： 青霉素 、 制霉菌素等抗生素作用于生長(zhǎng)著的微生物細(xì)胞 ， 對(duì)休止態(tài)細(xì)胞無作用 。 原養(yǎng)型 ： 指營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株回復(fù)突變或重組后產(chǎn)生的菌株，與野生型的表型相同。 方法：梯度平板法（ gradient plate） 抗藥性突變株的應(yīng)用： ?作為菌株的遺傳標(biāo)記 ?作為生產(chǎn)菌種（結(jié)構(gòu)類似物抗性變異株） ： ★ 與營(yíng)養(yǎng)缺陷突變有關(guān)的三類遺傳型個(gè)體： 營(yíng)養(yǎng)缺陷型 ： 經(jīng)誘變產(chǎn)生的一些合成能力出現(xiàn)缺陷，而必須在培養(yǎng)基內(nèi)加入相應(yīng)有機(jī)養(yǎng)分才能正常生長(zhǎng)的變異菌株。 篩選是 最為艱難的也是最為重要 的步驟 . 可見，設(shè)計(jì)和采用效率高的篩選方案和方法極其重要。 一種較有效的簡(jiǎn)易處理方法的大致操作步驟是：先在平板上涂上出發(fā)菌株細(xì)胞 ， 然后在平板上均勻地放上幾顆很小的誘變劑顆粒 （ 也可放吸有誘變劑溶液的濾紙片 ） ， 經(jīng)培養(yǎng)后 ， 在制菌圈的邊緣挑取若干突變菌落 ， 分別制成懸浮液 ， 然后將其涂在一般平板表面使長(zhǎng)出許多單菌落 ， 最后可用影印培養(yǎng)法或逐個(gè)檢出法選出突變種 。 最適劑量的選擇 ：產(chǎn)量性狀的育種中多傾向于低劑量（致死率在 70~80%） ? 選擇誘變劑的種類 ：在選用理化因子作誘變劑時(shí) ， 在同樣效果下 ， 應(yīng)選用 最方便 的因素；而在同樣方便的情況下 ，則應(yīng)選擇 最高效 的因素 。 ② 加０ .3%吐溫 80（表面活性劑） ③用無菌脫脂棉過濾。 ? 誘變育種具有極其重要的實(shí)踐意義 。一定的死亡率必定對(duì)應(yīng)一定的照射劑量，所以，在實(shí)際應(yīng)用中，用死亡率表示照射劑量更可靠。 連接酶 將新合成的 3’OH與原有的 5’ P相連接。這種修復(fù)作用與光無關(guān)。每一 有 25個(gè)光激活酶分子。 – 這一現(xiàn)象最早是 （ 1949）在 Strepotomyces griseus（灰色鏈霉菌）中發(fā)現(xiàn)的。 二聚體的出現(xiàn)會(huì)減弱雙鏈間氫鍵的作用，并引起雙鏈結(jié)構(gòu)扭曲變形，阻礙堿基間的正常配對(duì)，從而有可能引起突變或死亡。 ? 嘧啶對(duì)紫外線的敏感性要比嘌呤強(qiáng)得多。下圖就是環(huán)出效應(yīng)的設(shè)想機(jī)制。在運(yùn)用數(shù)學(xué)方法對(duì)這些偶然事件做大量統(tǒng)計(jì)分析后，可以發(fā)現(xiàn)并掌握其中的規(guī)律。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣的原因。 ? 自發(fā)突變 是指在沒有人工參與下生物體自然發(fā)生的突變。 轉(zhuǎn)座因子的種類 （ 3） ? Mu噬菌體（即 mutator phage，誘變噬菌體） ：它是 E . coli的一種溫和噬菌體。 IS引起的突變可以回復(fù) ， 其原因可能是 IS被切離 ， 如果因切離部位有誤而帶走 IS以外的一部分DNA序列 ， 就會(huì)在插入部位造成缺失 ， 從而發(fā)生新的突變 。 可以在染色體 、 F因子等質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)它們 。在這些 DNA順序的跳躍過程中，往往導(dǎo)致 DNA鏈的斷裂或重接，從而產(chǎn)生重組交換或使某些基因啟動(dòng)或關(guān)閉，結(jié)果導(dǎo)致突變的發(fā)生。 ? 染色體間畸變 ：指非同源染色體間的 易位 。 ? 有人認(rèn)為，由于它們是一種平面型三環(huán)分子，結(jié)構(gòu)與一個(gè) 嘌呤 –嘧啶 對(duì) 十分相似，故能 嵌入兩個(gè)相鄰 DNA堿基對(duì)之間，造成雙螺旋的部分解開（兩個(gè)堿基對(duì)原來相距 ，當(dāng)嵌入一個(gè)丫啶分子時(shí)，就變成 ），從而在 DNA復(fù)制過程中，會(huì)使鏈上增添或缺失一個(gè)堿基，結(jié)果就引起了移碼突變。 ? 丫啶類染料，包括原黃素、丫啶黃、丫啶橙和 α氨基丫啶等，以及一系列稱為 ICR類的化合物，都是移碼突變的有效誘變劑。 ? 也可以知道，為什么像 5BU這類代謝類似物只有對(duì)正在進(jìn)行新陳代謝和繁殖著的微生物才起作用，而對(duì)休止細(xì)胞、游離的噬菌體粒子或離體的 DNA分子卻不起作用。 亞硝酸引起的 ATGC轉(zhuǎn)換細(xì)節(jié) 這類誘變劑主要是一些 堿基類似物 ,如： 5溴尿嘧啶 (5BU)和 5氨基尿嘧啶（ 5—AU）、 疊氮胸腺嘧啶（AIT）等 等 ； 作用方式 ： 通過活細(xì)胞的代謝活動(dòng)參入到 DNA分子中，主要是在 DNA復(fù)制時(shí)堿基類似物插入 DNA中， 引起堿基對(duì)配對(duì)錯(cuò)誤，造成堿基置換。 – 能引起顛換的誘變劑很少，只是部分烷化劑才有（參見下表）。 ? 種類：很多。 ? 分類： 轉(zhuǎn)換（ transition），即 DNA鏈中的一個(gè)嘌呤被另一個(gè)嘌呤或是一個(gè)嘧啶被另一個(gè)嘧啶所置換； 顛換（ transversion） ，即一個(gè)嘌呤被一個(gè)嘧啶 ,或是一個(gè)嘧啶被一個(gè)嘌呤所置換。即使是同一種誘變劑，也常有幾種作用方式。 平板影印培養(yǎng)法 在根本未接觸過任何一點(diǎn)鏈霉素的情況下，就可以篩選到大量抗鏈霉素的突變株，充分說明了突變是自發(fā)產(chǎn)生的，鏈霉素只是起到了一種檢出作用。然后可把這一 “ 印章 ” 上的菌落一一接種到不同的選擇性培養(yǎng)基平板上。ck 根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，設(shè)計(jì)了左方的實(shí)驗(yàn)。由于其中有自發(fā)突變、誘發(fā)突變、誘變劑與選擇條件等多種因素錯(cuò)綜在一起，所以難以探究問題的實(shí)質(zhì)。 （四）基因突變的自發(fā)性和不對(duì)應(yīng)性的證明 ? 在各種基因突變中，抗性突變最為常見。 ?獨(dú)立性 ：各種突變獨(dú)立發(fā)生 ， 不會(huì)互相影響 。 （二）突變率 若干細(xì)菌某一性狀的自發(fā)突變率 ? 菌 名 突變性狀 突變率 ? E. coli 抗 T1噬菌體 3 10–8 ? E. coli 抗 T3噬菌體 1 10–7 ? E. coli 不發(fā)酵乳糖 1 10–10 ? E. coli 抗紫外線 1 10–5 ? Staphylococcus aureus 抗青霉素 1 10–7 ? S. aureus 抗鏈霉素 1 10–9 ? Salmonella typhi 抗 25?g/L鏈霉素 1 10–6 ? Bacillus megaterium 抗異煙肼 5 10–5 （三）突變的特點(diǎn) 適用于整個(gè)生物界 ， 以細(xì)菌的抗藥性為例 。 ? 突變率 =突變細(xì)胞數(shù) /分裂前群體細(xì)胞數(shù) ? 突變是 獨(dú)立 的 。 ? 定義： 每一細(xì)胞在每一世代中發(fā)生某一性狀突變的幾率。 ? 起始密碼子 ： AUG，甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸 ? 終止密碼子 ： UAA、 UGA、 UAG 核外 DNA的種類 ? 核外染色體 真核生物的 “ 質(zhì)粒 ” 原核生物的質(zhì)粒 線粒體 細(xì)胞質(zhì)基因 葉綠體 （ 質(zhì)體 ） 中心體 動(dòng) 體 共生生物： 卡巴顆粒 酵母菌的 2?m質(zhì)粒 F因子 R因子 Col質(zhì)粒 Ti質(zhì)粒 巨大質(zhì)粒 降解性質(zhì)粒 第二節(jié) 基因突變和誘變育種 ? 突變（ mutation ）： 指生物體的表型突然發(fā)生的可遺傳的變化。 ?5. Ti質(zhì)粒 （ tumor inducing plasmid） ? 是近年來在 Rhizobium（根瘤菌屬）中發(fā)現(xiàn)的一種質(zhì)粒，分子量為 200~300 106Dalton，比一般質(zhì)粒大幾十倍到幾百倍，故稱巨大質(zhì)粒，其上有一系列固氮基因。這時(shí)，含有復(fù)制基因的 Ti質(zhì)粒的小片段與植物細(xì)胞中的核染色體發(fā)生整合，破壞控制細(xì)胞分裂的激素調(diào)節(jié)系統(tǒng)，從而使它轉(zhuǎn)變成癌細(xì)胞。這些質(zhì)粒以其所分解的底物命名，例如有分解 CAM（樟腦）質(zhì)粒， XYL（二甲苯）質(zhì)粒，SAL（水楊酸）質(zhì)粒， MDL（扁桃酸）質(zhì)粒，NAP（奈）質(zhì)粒和 TOL（甲苯）質(zhì)粒等。 – ColIb分子量約為 80 106Dalton， 它與 F因子相似， 具有通過接合作用轉(zhuǎn)移的功能，屬于嚴(yán)緊型控制，只有1~2個(gè) copy。其分子量約 4 104~8 104Dalton。其上帶有其它抗生素的抗性基因。 鑒定： 電鏡觀察、電泳、密度梯度離心、限制性酶切圖譜等方法 三、原核生物的質(zhì)粒 幾種代表性質(zhì)粒： ?1. F–因子（ fertility factor） ：又稱致育因子或性因子， 62 106Dalton， ，相當(dāng)于核染色體 DNA2%的環(huán)狀雙鏈DNA，足以編碼 94個(gè)中等大小多肽，其中 1/3基因（ tra區(qū)）與接合作用有關(guān)。 ③ 可以通過轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)或接合作用而由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)菌細(xì)胞中，使兩個(gè)細(xì)胞都成為帶有質(zhì)粒的細(xì)胞；質(zhì)粒轉(zhuǎn)移時(shí)，它可以單獨(dú)轉(zhuǎn)移，也可以攜帶著染色體（片段）一起進(jìn)行轉(zhuǎn)移，所以它可成為基因工程的載體。 上述結(jié)果說明 ， 在 RNA病毒中 ，遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)也是核酸 。 （ 二 ） 噬菌體感染實(shí)驗(yàn) A. D. Hershey和 M. Chase， 1952年 （ 1） 含 32PDNA的一組：放射性 85%在沉淀中 10分鐘后 用搗碎器 使空殼脫離 吸附 離心 沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體 上清液中含 15%放射性 沉淀中含 85%放射性 沉淀中含 25%放射性 以 32S標(biāo)記蛋白質(zhì)外殼做噬菌體感染實(shí)驗(yàn) （ 2） 含 35S蛋白質(zhì)的一組：放射性 75%在上清液中 10分鐘后 用搗碎器 使空殼脫離 吸附 離心 沉淀細(xì)胞進(jìn)一步培養(yǎng)后，可產(chǎn)生大量完整的子代噬菌體 上清液中含 75%放射性 （ 三 ） 植物病毒的重建實(shí)驗(yàn) 為了證明核酸是遺傳物質(zhì) ， H. FraenkelConrat（ 1956） 用含 RNA的煙草花葉病毒 （ TMV）進(jìn)行了著名的植物病毒重建實(shí)驗(yàn) 。 熱死 SIII菌 —————不生長(zhǎng) 活 RII 菌 —————長(zhǎng)出 RII菌 熱死 SIII菌 —————長(zhǎng)出大量 RII菌和 106SIII菌 活 R菌 +S菌無細(xì)胞抽提液 ——長(zhǎng)出大量 R菌和少量 S菌 +活 RII菌 平皿培養(yǎng) ① 加 S菌 DNA ② 加 S菌 DNA及 DNA酶以外的酶 ③ 加 S菌的 DNA和 DNA酶 ④ 加 S菌的 RNA ⑤ 加 S菌的蛋白質(zhì) ⑥ 加 S菌的莢膜多糖 活 R菌 長(zhǎng)出 S菌 只有 R菌 1944年 、 M。 但染色體是由核酸和蛋白質(zhì)兩種長(zhǎng)鏈高分子組成 。 例如：粘質(zhì)沙雷氏菌： 在 25℃ 下培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色的靈桿菌素；在 37℃ 下培養(yǎng)，不產(chǎn)生色素；如果重新將溫度降到 25℃ ，又恢復(fù)產(chǎn)色素的能力。 變異的特點(diǎn)： 極低的幾率出現(xiàn) ， （ 一般為 106～ 1010） ； 的幅度大； c. 變化后形成的新性狀是穩(wěn)定的 ， 可遺傳的 。 遺傳型 （ genotype） ：又稱基因型 ， 指某一生物個(gè)體所含有的全部基因的總和； 是一種內(nèi)在可能性或潛力 。 對(duì)微生物遺傳規(guī)律的深入研究 ， 不僅促進(jìn)了 現(xiàn)代分子生物學(xué) 和 生物工程學(xué) 的發(fā)展 ， 而且為 育種工作 提供了豐富的理論基礎(chǔ) ， 促使育種工作從不自覺到自覺 、 從低效到高效 、 從隨機(jī)到定向 、從近緣雜交到遠(yuǎn)緣雜交的方向發(fā)展 。 微生物的獨(dú)特生物學(xué)特性： （ 1） 個(gè)體的體制極其簡(jiǎn)單； （ 2） 營(yíng)養(yǎng)體一般都是單倍體； （ 3） 易于在成分簡(jiǎn)單的組合培養(yǎng)基上大量生長(zhǎng)繁殖； （ 4） 繁殖速度快； （ 5） 易于積累不同的中間代謝產(chǎn)物或終產(chǎn)物； （ 6） 菌落形態(tài)特征的可見性和多樣性； （ 7） 環(huán)境條件對(duì)微生物群體中各個(gè)個(gè)體作用的直接性和均一性； （ 8） 易于形成營(yíng)養(yǎng)缺陷型； （ 9） 各種微生物一般都有相應(yīng)的病毒； （ 10） 存在多種處于進(jìn)化過程中的原始有性生殖方式； 微生物是研究現(xiàn)代遺傳學(xué)和其它許多主要的生物學(xué)基本理論問題中最熱衷的 研究對(duì)象 。 特點(diǎn)：具穩(wěn)定性 。 代謝 發(fā)育 變異 (variation):生物體在外因 或內(nèi)因的作用下 ， 遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)或數(shù)量發(fā)生改變 。引起飾變的因素消失后 ， 表型即可恢復(fù) 。 基因?qū)W說 ： 1933年摩爾根 （ Thomas Hunt Man） 發(fā)現(xiàn)了染色體 ， 并證明基因在染色體上呈直線排列 ， 提出了基因?qū)W說 ， 使得遺傳物質(zhì)基礎(chǔ)的范圍縮小到染色體上 。 1928年， Griffith進(jìn)行了以下幾組實(shí)驗(yàn)： （ 1）動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 對(duì)小鼠注射活 RII菌或死 SIII菌 ————小鼠存活 對(duì)小鼠注射活 SIII菌 ————————小鼠死亡 對(duì)小鼠注射活 RII