第二章基因工程工具酶(編輯修改稿)
2024-11-19 22:12 本頁面
【文章內容簡介】 解決辦法是： 選用無甲基化酶的突變菌株； 使用對甲基化酶堿基無切割能力的酶（對哺乳動物DNA）。,?,（4）酶切反應的溫度與時間 所有限制性內切酶均應在標準條件下進行，大多數最適反應溫度是37℃，少數耐熱 TaqⅠ是65℃；Sma Ⅰ是25 ℃（30 ℃ ）。反應時間與酶量有關。 （5）DNA分子的構型 不同構型的影響很大：消化超螺旋環(huán)狀DNA用的酶量大于線性DNA 不同位點切割能力不同 （6）限制性核酸內切酶的反應緩沖液 Mg2+，TrisHCl，NaCl或KCl 223。巰基乙醇或二硫蘇糖醇(DTT)(防止酶氧化,以保持活性) BSA（牛血清白蛋白）穩(wěn)定酶蛋白。,?,（七）其它水解核酸的酶 1. 水解RNA的核酸酶(Rnase):種類很多介紹五種 酶名稱 來源 最適PH 作用特點 反應式 應用 RNaseA 胰臟 7.9 切嘧啶產生 ApUpCpNp RNA測序 3’p嘧啶核苷 酸或以其結 ApUp+Cp+Np 尾的寡核苷酸 RNaseT1 米曲霉 4.5 切G產生3’Gp GpGpApCpGp 同上 或以其為結尾 的寡核苷酸 Gp+Gp+ApCpGp RNaseU2黑曲霉 4.5 切A產生3‘AP GpApCpApAp 同上 或以其結尾的 寡核苷酸片段 GpAp+CpAp+Ap RNasephy頭絨孢菌 不切C產生3’Ap, GpApCpUpGp 同上 3’Gp,3’Up或以其 為結尾片段 GpApCpUpGp,RNaseH 大腸桿菌 水解DNARNA雜交 分子中的RNA,?,2 核酸酶S 來自稻谷曲霉 高度特異性于單鏈核酸的內切酶：可催化單鏈RNA或DNA，降解成5’單核苷酸。同時也可作用于雙鏈核酸分子的單鏈區(qū)（小到一個堿基）。 作用： 測定雜交分子（DNADNA)或(RNADNA)的雜交程度，即使是一對堿基沒雜交也能檢測到。 cDNA合成時去掉第一連與第二連的發(fā)夾結構 測定DNA上內含子的位置,?,（一）DNA連接酶的概念與作用機制 （二） 連接酶種類及特性的比較 （三） DNA連接酶作用的特點 （四） DNA連接酶的反應條件 （五）影響連接反應的因素DNA連接的策略 （六）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和 載體連接的一般方案,二、 DNA連接酶及其應用,DNA重組的核心技術：DNA片段之間的體外連接 ——連接酶。,?,（一）DNA連接酶的概念與作用機制,環(huán)形DNA分子的發(fā)現使科學家相信一定有一種能連接這種切口的酶存在。 首個DNA連接酶(ligase)——1967年，大腸桿菌DNA連接酶，是大腸桿菌基因編碼 。 1970年，發(fā)現了T4DNA連接酶 ， 由大腸桿菌T4噬菌體基因編碼的。 概念： DNA連接酶（Ligase） 能夠催化兩條DNA鏈之間形成磷酸二酯鍵的酶。,?,DNA連接酶的催化反應 DNA ligase + NAD+/ATP ↓ 酶AMP復合物 ↓+DNA AMPDNA ↓ 相鄰3’OH對活化的磷原子發(fā)生親核攻擊 ↓→AMP 3’,5’磷酸二酯鍵,DNA 連接酶連接的作用機制,?,（二）連接酶種類及特性的比較,最常用,?,（三）DNA連接酶作用的特點,A. 連接的兩條鏈必須分別具有自由3’OH和5’P，而且這兩個基團彼此相鄰； B. 在羥基和磷酸基團間形成磷酸二酯鍵是一種耗能過程。,E.coli DNA連接酶 －連接具互補堿基黏性末端(最初研究表明），現在研究可連接平末端；需NAD+輔助因子，活性低，不常用。 T4DNA連接酶－連接具互補堿基黏性末端和平末端， 需ATP輔助因子，活性高，常用。,?,是雙鏈－因此不能將兩條單鏈連接起來或使單鏈環(huán)化起來。 OH P 是相鄰的－因此不能封閉gap，只能封閉nick.,,gap NO,Nick OK,?,（四）T4 DNA連接酶連接反應的條件,連接酶反應體系,連接液滅活后最好立即轉化或儲存于48℃，時間不要太長，會降低轉化率。,?,DNA末端的濃度 較高濃度的DNA，利于分子間連接，形成線性二聚體或多聚體分子。 溫度（通常在416℃ ） ATP的濃度(10μmol／L —1mol／L ) 連接酶濃度（一般平末端大約需1～2U，粘末端僅需0.1U） 反應時間（通常連接過夜） 插入片段和載體片段的摩爾比（ 1∶1～5∶1）,（五）影響連接反應的因素,?,（六）T4 DNA連接酶對目的DNA片段和載體連接的一般方案,1．連接反應一般在滅菌的0.20.5ml離心管中進行。 2．10μl體積反應體系中：取載體50100ng
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