基因工程的工具酶(編輯修改稿)
2025-01-25 17:53 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 DNA上的 3’ － OH對(duì)被活化的磷原子進(jìn)行親核攻擊 ， 形成磷酸二酯鍵 ， 同時(shí)釋放出 AMP。 DNA連接反應(yīng)的條件 4℃ 過夜 加反應(yīng)液 連接反應(yīng)最佳溫度為 37℃ ，但是此時(shí)粘性末端間氫鍵結(jié)合不夠穩(wěn)定，而且酶活性也會(huì)迅速降低。比如， EcoRI 粘性末端連接部位只有 4個(gè)堿基對(duì)，很容易斷開。所以 通常在 415℃ 連接。 影響連接效率的因素有： A. 溫度（最主要的因素） B. ATP的濃度 ( 10?M 1?M ) C. 連接酶濃度（平末端較粘性末端要求高） D. 反應(yīng)時(shí)間（通常連接過夜） E. 插入片段和載體片段的摩爾比 粘性末端 DNA片段的連接 Nick Nick 平末端 DNA片段的末端加尾連接法 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 末端核苷酸轉(zhuǎn)移酶 +dATP +dTTP 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ AAAAA TTTT DNA聚合酶 和 T4DNA連接酶 同聚物加尾法 用 5’ 末端特異的核酸外切酶處理 DNA片斷 在 A和 B分別中加入 dATP和 dTTP 同聚物尾巴 10~40個(gè)堿基 平末端 DNA片段加接頭連接法 銜接物 (linker) ， 是有人工化學(xué)合成的一段 1012個(gè)核苷酸的 DNA雙鏈，其中包含有 1個(gè)或幾個(gè)限制性酶切位點(diǎn)。使用時(shí)只須將銜接物和目的片段的 5′ 端用 多核苷酸激酶 處理使之磷酸化，然后用 T4DNA連接酶進(jìn)行連接，就可獲得能產(chǎn)生粘性末端的DNA片段。 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC 磷酸化 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC P OH OH P P P OH OH T4連接酶 CCGAATTCGG GGCTTAAGCC P OH P OH EcoR I CCGAATTCGG GGCTTAAGCC AATTCGG GCC CCG GGCTTAA 接頭 載體去磷防止自連的應(yīng)用示例 P OH P OH OH OH OH OH P OH P OH OH OH OH OH 連接酶 連接酶 連接酶 堿性磷酸酶 2Pi 寄主修復(fù)缺口 載體自連或產(chǎn)生二聚體等 雙銜接物連接法的基本程序 cDNA鏈的合成 通過 DNA聚合酶合成第二鏈 加入 Sal I銜接物 S I核酸酶作用后的末端單鏈突出序列， 由 Klenow補(bǔ)齊，加入第二銜接物 Ecol I 銜接物缺點(diǎn) 在用 DNA銜接物連接法時(shí)，如果待克隆 DNA的片斷或基因內(nèi)部，含有與所加銜接物相同的限制位點(diǎn)，在酶切消化銜接物產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的基因切斷。 DNA接頭（ adapter）連接法： 1978年，美國康奈爾大學(xué)生化分子生物學(xué)系的教授吳瑞博士發(fā)明的。 它是一類人工合成的一頭具有某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片斷。 粘性末端容易通過堿基配對(duì)形成如同銜接物一樣的二聚體分子。對(duì) DNA接頭分子末端，進(jìn)行必要的修飾。移走粘性末端 5’ P，暴露出 5’ OH，不能產(chǎn)生穩(wěn)定的二聚體分子。 DNA接頭 DNA接頭連接法 1. 大腸桿菌 DNA聚合酶 I 2. Klenow片段 3. T4 DNA聚合酶 4. T7 DNA聚合酶 5. 逆轉(zhuǎn)錄酶（反轉(zhuǎn)錄酶） 6. Taq DNA聚合酶 DNA聚合酶 Kornberg 1956年首先從大腸桿菌 細(xì)胞中分離出來的。它是一種多功能性的酶，包括 3種不同的酶活力： A. 5′ 3′聚合酶活性 以雙鏈 DNA為模板，催化單核苷酸結(jié)合到引物的 3′末端，并不斷延伸。 B. 5′ 3′外切酶活性 將雙鏈 DNA中游離的 5′末端逐個(gè)切去。 C. 3′ 5′外切酶活性 將游離的雙鏈或單鏈 DNA的 3′端降解。不過對(duì)于雙鏈的降解可被 5′3′的多聚活性所抑制。 大腸桿菌 DNA聚合酶 I （ E. Coli DNA pol I） 大腸桿菌三種 DNA聚合酶特性比較 大腸桿菌聚合酶 Ⅰ 的應(yīng)用示例 ? 缺口平移： 雙鏈 DNA的單鏈缺口在 DNA聚合酶 Ⅰ 的 5’ 3’外切作用下，從缺口的 5’端逐步水解核苷酸時(shí)，酶的聚合活性則利用缺口的 3’端游離羥基逐個(gè)加上相應(yīng)的單核苷酸，使得缺口向下游移動(dòng)。 大腸桿菌聚合酶 I 的應(yīng)用示例C C G A T A G C C TG G C T A T C G G AC C G A T A G C C TG G C T A T C G G AP o l I + M g2+缺口轉(zhuǎn)移( Nic k tra nslation)CCGG G C T A T C G G ACCGG G C T A T C G G AP o l I + M g2+A T A G CCT大腸桿菌聚合酶缺口轉(zhuǎn)移內(nèi)切酶 大腸桿菌 DNA聚合酶 I 的三種用途 A. 制備 DNA探針 利用其 3′5′的外切酶活性及其聚合酶活性。 B. 用于 DNA連接后的大缺口填充 利用 5′3′的聚合酶活性。 C. 用于 DNA的序列分析 利用 5′3′的聚合酶活性。 Klenow片段 Klenow片段 大腸桿菌聚合酶 I全酶經(jīng) 枯草桿菌蛋白酶 處理后產(chǎn)生的大片段酶分子，它仍然有 5′→3′ 的聚合酶活性和 3′→ 5 ′ 的核酸外切酶活性，但失去了 5′→3′ 的外切酶活性。 Klenow片段的主要用途 A. 修補(bǔ)限制性酶消化 DNA形成的 3′ 隱蔽末端 B. 標(biāo)記 DNA片段的末端 C. cDNA克隆中第二鏈 cDNA的合成 D. DNA序列的測定 GAA CTTAA T4DNA聚合酶的特點(diǎn) T4DNA聚合酶 從 T4噬菌體感染了的大腸桿菌中分離出來的，它和 Klenow片段一樣具有 5′→3′ 的聚合酶活性和 3 ′→ 5 ′ 的核酸外切酶活性。 其外切酶活性要比大腸桿菌聚合酶 I 的活性
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