基因工程工具酶限制酶(編輯修改稿)
2025-06-22 06:03 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 限制酶的作用所造成的 DNA分子的 切割類型 ， 通常是屬于下述兩種獨(dú)特的排列方式之一： （ 1） 兩條鏈上的斷裂位置是交錯地 、 但又是對稱地圍繞著一個對稱軸排列 ， 這種形式的斷裂結(jié)果形成具有 粘性末端 的 DNA片段； （ 2） 兩條鏈上的斷裂位置是處在一個對稱結(jié)構(gòu)的中心 ， 這樣形式的斷裂是形成具有 平末端 的DNA片段 。 c. 產(chǎn)生的末端特征： 我們所說的 粘性末端 是指 DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互補(bǔ)堿基的單鏈延伸末端結(jié)構(gòu) ， 它們能夠通過互補(bǔ)堿基間的配對而重新環(huán)化起來 。 平末端 的 DNA片段則不易于重新環(huán)化 。 (2) 同裂酶 (isoschizomers) 有一些來源不同的限制酶識別的是同樣的核苷酸靶序列 ， 這類酶特稱為 同裂酶 (isoschizomers)。 同裂酶產(chǎn)生同樣的切割 ， 形成同樣的末端 。 例如 ， 限制酶 HpaⅡ 和MspI是一對同裂酶 ， 共同的靶子序列是 CCGG。 與同裂酶對應(yīng)的一類限制性內(nèi)切酶 ,它們雖然來源不同，識別的靶序列也各不相同 ,但都能產(chǎn)生相同的粘性末端 ,特稱為 同尾酶 。 常用的 BamH I, Bcl I, Bgl I,Xho I就是一組同尾酶。它們切割 DNA之后都形成由 GATC 4個核苷酸組成的粘性末端，很顯然，由同尾酶所產(chǎn)生的 DNA片段，是能夠通過其粘性末端之間的互補(bǔ)作用而彼此連接起來的，因此在基因克隆實驗中很有用處。 (3) 同尾酶 (isocaudamer) 由一對同尾酶分別產(chǎn)生的粘性末端共價結(jié)合形成的位點(diǎn) ， 特稱之為 “ 雜種位點(diǎn) ” (hybrid site)。 但必須指出 ， 這類雜種位點(diǎn)的結(jié)構(gòu) ， 一般是不再被原來的任何一種同尾酶所識別的 。 例如： Sal I（ 5`G TCGAC3`） 和 Xho I(5`C TCGAG3`)的消化片段相連 ，但所形成的重組片段 （ 5`GTCGAG3`） 則不能被上述 2種酶的任一種酶識別和切割 。但也有例外 。 5． 影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素 (1) DNA的純度 核酸內(nèi)切限制酶消化 DNA底物的反應(yīng)效率 ，在很大程度上是取決于所使用的 DNA本身的純度。 污染在 DNA制劑中的某些物質(zhì) ， 例如蛋白質(zhì) 、酚 、 氯仿 、 酒精 、 乙二胺四乙酸 (EDTA)、 SDS(十二烷基硫酸鈉 )、 以及高濃度的鹽離子等 ， 都有可能抑制核酸內(nèi)切限制酶的活性 。 為了提高核酸內(nèi)切酶對低純度 DNA的反應(yīng)效率 ， 一般采用如下三種方法： ① 增加核酸內(nèi)切限制酶的用量 ， 平均每微克底物 DNA可高達(dá) 10單位甚至更多些 。 ② 擴(kuò)大酶催化反應(yīng)的體積 ， 以使?jié)撛诘囊种埔蛩乇幌鄳?yīng)地稀釋 。 ③ 延長酶催化反應(yīng)的保溫時間 。 在有些 DNA制劑中，尤其是按微量堿法制備的，會含有少量的 DNase的污染。由于 DNase的活性需要有Mg2+的存在，而在 DNA的貯存緩沖液中含有二價金屬離子螯
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