生物技術(shù)課件——02基因工程常用工具酶(編輯修改稿)
2025-02-04 02:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 ? 維持性甲基化酶：用于在新合成的 DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。甲基化位置與模板鏈上的相同。 ? 構(gòu)建性甲基化酶：用于在非甲基化的 DNA鏈上進(jìn)行甲基化的酶。 ? 用甲基化酶進(jìn)行甲基化的作用 ? 封閉 DNA鏈中的某些識(shí)別位點(diǎn)，保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。 ? 構(gòu)建新的酶切位點(diǎn) ? 能夠催化 DNA中相鄰的 3’ 羥基和 5’ 磷酸基團(tuán)末端之間形成 3′, 5′ 磷酸二酯鍵的酶。 ? T4 DNA連接酶：可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈 DNA分子相互連接。 ? 大腸桿菌 DNA連接酶：只能連接帶匹配粘末端的 DNA分子。 ? DNA連接酶需要在一條 DNA鏈的 3’ －末端具有游離羥基（－ OH），另一條鏈 5’ －末端具有磷酸基（－ P）時(shí)才可發(fā)揮作用。 ? 3’ － OH和 5’ － P需彼此相鄰，且各自位于與互補(bǔ)鏈上互補(bǔ)堿基配對(duì)的兩個(gè)脫氧核苷酸末端。 ? DNＡ連接酶不能連接單鏈 DNA分子，只能連接雙螺旋 DNA分子的一部分。 ? DNA連接酶只能封閉失去一個(gè)磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈切口（ nick），不能封閉失去一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸所形成的缺口（ gap）。 ? DNA連接酶反應(yīng)時(shí)需要能量（ NAD＋ 或 ATP）。 ? 切口： 失去磷酸二酯鍵 ? 缺口：失去核苷酸 5‘ 3’ 3‘ 5’ 5‘ 3’ 3‘ 5’ ? T4噬菌體 DNA連接酶 ? 由大腸桿菌 T4噬菌體 DNA編碼，分子量 68KD，需ATP。 ? 可以連接互補(bǔ)的粘性末端。如： ? 5’…ACG OH pAATTCGT…3’ T4DNA連接酶 3’…TGCTTAAp HO GCA…5’ Mg2＋ ，ATP ? 5’…ACGAATTCGT…3’ 3’…TGCTTAAGCA…5 ? 反應(yīng)系統(tǒng)： ATP， Tris－ HCl， MgCl2， DTE（二硫赤蘚糖醇）， ATP， 4～ 15℃ ? 也可以連接兩條平起末端的 DNA分子，但反應(yīng)速度較慢。 ? 5’…CGAOH PCGTA…3’ T4DNA連接酶 3’…GCTP HOGCAT…5’ Mg2＋ ，ATP ? 5’…CGACGTA…3’ 3’…GCTGCAT…5’ ? 可以實(shí)現(xiàn)分子間或分子內(nèi)連接。 AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 5180。 5180。 (1) (2) AATTC G G CTTAA AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 AATTC G G CTTAA 5180。 5180。 (a)分子間連接 (b)分子內(nèi)連接 (1) (2) AT G C T A TA G C T A T4連接酶 T4連接酶 ? 大腸桿菌 DNA連接酶 ? 只催化有匹配粘性末端的 DNA分子 ? 需有 NAD＋ （氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）做能源輔助因子。 ? 反應(yīng)緩沖體系： Tris－ HCl， MgCl2， EDTA，DTE（二硫赤蘚糖醇）， NAD， BSA， ， 4－ 15℃ 。
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