生物技術(shù)課件——02基因工程常用工具酶-文庫吧資料
2025-01-14 02:09本頁面
【正文】 ? 探針：用來探知被測(cè)物存在的小 DNA或 RNA叫做探針。 TCGATAGCC AGCTAT DNApolI Mg 2+ TCGATA AGCTAT + pC， pG 5′ TCGATA AGCTATCGG TCGATAGCC AGCTATCGG DNApolI Mg 2+ + pC， pG， pA 5′ DNA聚合酶 Ⅰ 在分子克隆中的主要用途是通過 DNA切口平移，制備供核酸分子雜交用的帶放射性標(biāo)記的 DNA探針。 ? 只對(duì) DNA配對(duì)部分即雙鏈的磷酸二酯鍵有切割作用。 ? （ 1） 5′→ 3′ 聚合酶活性： ? 以單鏈 DNA為模板，在 DNA引物 3’OH末端聚合上脫氧核苷三磷酸。 DNA聚合酶 Ⅰ 在 DNA復(fù)制過程中的作用 ? 大腸桿菌 DNA聚合酶 Ⅰ( 全酶 ) ? Klenow片段 ? T４ DNA聚合酶 (T４ Phage感染的 ) ? 修飾的 T７ DNA聚合酶 (測(cè)序酶 ) ? TaqDNA聚合酶 (耐熱 ) ? 反轉(zhuǎn)錄酶 ? 有大腸桿菌 polA基因編碼的一種單鏈多肽蛋白質(zhì)， MW = 109， 000 D，約有 1000個(gè)氨基酸，分子中含有一個(gè)雙硫鍵，一個(gè)硫氫鍵，還含有鋅離子，橢圓型結(jié)構(gòu)。其中聚合酶 Ⅰ 參與 DNA修復(fù)，聚合酶 Ⅲ 參與 DNA復(fù)制。 ? DNA聚合酶在 DNA復(fù)制 時(shí)起關(guān)鍵作用。 ? 反應(yīng)緩沖體系： Tris－ HCl， MgCl2， EDTA，DTE（二硫赤蘚糖醇）， NAD， BSA， ， 4－ 15℃ 。 5180。 5180。 5180。 5180。 ? 5’…CGAOH PCGTA…3’ T4DNA連接酶 3’…GCTP HOGCAT…5’ Mg2＋ ，ATP ? 5’…CGACGTA…3’ 3’…GCTGCAT…5’ ? 可以實(shí)現(xiàn)分子間或分子內(nèi)連接。 ? 可以連接互補(bǔ)的粘性末端。 ? DNA連接酶反應(yīng)時(shí)需要能量（ NAD＋ 或 ATP）。 ? DNＡ連接酶不能連接單鏈 DNA分子，只能連接雙螺旋 DNA分子的一部分。 ? DNA連接酶需要在一條 DNA鏈的 3’ －末端具有游離羥基（－ OH），另一條鏈 5’ －末端具有磷酸基（－ P）時(shí)才可發(fā)揮作用。 ? T4 DNA連接酶：可連接帶匹配粘性末端的DNA分子，也可使平端的雙鏈 DNA分子相互連接。 ? 用甲基化酶進(jìn)行甲基化的作用 ? 封閉 DNA鏈中的某些識(shí)別位點(diǎn)，保護(hù)多余的限制性酶切位點(diǎn)。甲基化位置與模板鏈上的相同。 ? 甲基化酶也稱修飾酶 (modification enzyme)，用來修飾限制酶的識(shí)別序列，在該序列位點(diǎn)的胞嘧啶（ C） 5氨基上加一個(gè)甲基，使得該序列可以被限制性內(nèi)切酶識(shí)別而免于切割。 ? 重組 DNA前的切割 ? 構(gòu)建新質(zhì)粒 ? 構(gòu)建物理圖譜 ? DNA分子雜交 ? 用限制性內(nèi)切酶消化受體 DNA ? 制備 DNA探針 ? 亞克隆以用作序列分析 ? 基因定位， DNA同源性研究 ? Ⅱ 類 RM系統(tǒng)由限制性核酸內(nèi)切酶和甲基化酶兩種酶分子組成。星活性可造成位點(diǎn)切割機(jī)率不等，降解不完全。 ? 限制性內(nèi)切酶識(shí)別特異性放寬。 ? 同尾酶 ：來源不同，識(shí)別的核苷酸靶序列也不相同，但切割后 DNA分子產(chǎn)生的粘性末端相同的限制性核酸內(nèi)切酶。產(chǎn)生同樣的切割，形成同樣的末端。 ? 識(shí)別序列有連續(xù)的（如 GATC）和間斷的 (如GANTC)兩種，它們都呈回文結(jié)構(gòu)。 ? 絕大多數(shù)的 Ⅱ 型限制性核酸內(nèi)切酶都能夠識(shí)別由 48個(gè)核苷酸組成的特定的核苷酸序列。 ? 2個(gè)單鏈斷裂部位在 DNA分子上的分布，通常不是彼此直接相對(duì)。 限制性核酸內(nèi)切酶的命名 ? 50μ L Buffer中，含 1μ g底物 DNA，于最適反應(yīng)條件和溫度下，保溫 1小時(shí)，能使 1μ g DNA完全降解所需的酶
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