【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。 大腸桿菌細(xì)胞 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 得到噬菌斑或單菌落 與重組 DNA共同冰浴 而后 42℃ 短暫熱刺激 CaCl2處理 受體細(xì)菌 50100mmol/L CaCl2 感受態(tài)細(xì)菌 重組體轉(zhuǎn)入細(xì)菌 轉(zhuǎn) 化 ? 從 70℃ 冰箱中取 200μl感受態(tài)細(xì)胞懸液 ,室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。 ? 加入 pBS質(zhì)粒 DNA溶液 (含量不超過 50 ng,體積不超過 10μl)，輕輕搖勻，冰上放置 30分鐘后。 ? 42℃ 水浴中熱擊 90秒或 37℃ 水浴 5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻 35分鐘。 ? 向管中加入 1ml LB液體培養(yǎng)基 (不含 Amp)，混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1小時(shí)，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài) ,并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因 (Ampr )。 ? 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時(shí)，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿 ,37℃ 培養(yǎng) 1624小時(shí)。 ? 計(jì)算轉(zhuǎn)化率。 轉(zhuǎn)化的操作步驟 為了提高轉(zhuǎn)化效率 , 實(shí)驗(yàn)中要考慮以下幾個(gè)重要因素： ? 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA)。 ? 轉(zhuǎn)化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源 DNA的量過多或體積過大時(shí) ,轉(zhuǎn)化效率就會(huì)降低。 1 ng的 cccDNA即可使 50μl 的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。當(dāng)所轉(zhuǎn)化的ＤＮＡ很難得時(shí)（如用從相對(duì)難得的樣品中提取 mRNA而合成的 cDNA),這就顯得格外重要。 ? 一般情況下 ,DNA溶液的體積不應(yīng)超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5％。 對(duì)照實(shí)驗(yàn) ? ：在高壓電場(chǎng)下使細(xì)胞產(chǎn)生瞬間的穿孔，這個(gè)穿孔足夠大并可維持足夠的時(shí)間，使外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞。電穿孔法的轉(zhuǎn)化效率比鈣轉(zhuǎn)化法高 2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。這種方法也可用于真核生物的轉(zhuǎn)染。 轉(zhuǎn)化方法 真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 受體細(xì)胞系統(tǒng) 永生細(xì)胞系 細(xì)胞特異性的選擇標(biāo)記 對(duì)抗某種藥物 ? 電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。 ? 磷酸鈣轉(zhuǎn)染技術(shù)：主要用于動(dòng)物細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。將 DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在強(qiáng)烈震蕩下加入由 Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產(chǎn)生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細(xì)胞中，利用細(xì)胞的胞飲作用將 DNA導(dǎo)入到細(xì)胞中。磷酸鈣一方面可以增加細(xì)胞的通透性，一方面可以避免 DNA被細(xì)胞內(nèi)的核酸酶水解。 磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染 重組體 + 磷酸鈣微粒 內(nèi)吞作用 重組體進(jìn)入細(xì)胞 大顆粒 轉(zhuǎn)染方法 ? 基因槍轉(zhuǎn)染法： 利用被電場(chǎng)或機(jī)械加速的金屬微粒能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的基本原理，先將 DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使 DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 ? 激光微束穿孔法： 利用直徑很小、能量很高的激光束在細(xì)胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進(jìn)入細(xì)胞。 ? 顯微注射法： 利用毛細(xì)管直接將 DNA注入細(xì)胞內(nèi)。 ? 脂質(zhì)體（ liposome）介導(dǎo)法： 將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結(jié)構(gòu)內(nèi)，通過脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的融合而將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。 ? 多聚物介導(dǎo)法： 利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（ DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價(jià)陽(yáng)離子、 DNA混合形成沉淀顆粒，通過細(xì)胞的胞飲作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉(zhuǎn)（化宿主細(xì)胞） 篩（選陽(yáng)性克?。? 表（達(dá)目的基因） “縱向”體系 重組體克隆的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)化后的克隆群體： 陽(yáng)性重組子的 篩選與 鑒定 ? 遺傳檢測(cè)法 (根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選 ) 插入失活法 α互補(bǔ)法 ? 限制性酶切法 ? PCR法 ? 雜交篩選法 ? 免疫學(xué)方 法 ? 核苷酸序列測(cè)定法 遺傳檢測(cè)法 菌株為某種抗生缺陷型， 而質(zhì)粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉(zhuǎn)化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長(zhǎng)出。 對(duì)于帶有抗藥基因的質(zhì)粒重組體，可采用 插入滅活法 進(jìn)行篩選。如 pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當(dāng)將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細(xì)菌對(duì)氨芐青霉素耐藥，而對(duì)四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長(zhǎng)，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長(zhǎng)的細(xì)菌即為帶重組體的細(xì)菌。 如果外源 DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源 DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活 pBR322質(zhì)粒結(jié)構(gòu) pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 α互補(bǔ)法 —— 藍(lán)白篩選 ? 現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個(gè)大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有 β－半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調(diào)控序列和 N端１４６個(gè)氨基酸偏碼區(qū)（全長(zhǎng) 1201氨基酸） 。這個(gè)編碼區(qū)中插入一個(gè)多克隆位點(diǎn)。 ? 受體菌是 Z基因突變型，只含編碼 β－半乳糖苷酶Ｃ端 aa的序列。當(dāng)外源基因插入時(shí)，在 IPTG （異丙基硫代 βD半乳糖苷）誘導(dǎo)下合成 β－半乳糖苷酶 N端片斷，和受體菌的 C端片斷溶為一體后，可產(chǎn)生蛋白質(zhì)間的互補(bǔ)，形成有活性的 β－半乳糖苷酶，稱 α互補(bǔ)。 ? 具有 α互補(bǔ)的細(xì)菌培養(yǎng)在含 IPTG及 Xgal（ 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷）的培養(yǎng)基上。 Xgal本身是無(wú)色的，在半乳糖苷酶的水解下產(chǎn)生蘭色的物質(zhì)（被水解為無(wú)色的半乳糖及深蘭色的 5溴 4氯靛蘭），因此會(huì)形成藍(lán)色菌落。 ? 而當(dāng)有外源基因插入到多克隆原點(diǎn)，從而造成插入突變失活，則不能產(chǎn)生 α互補(bǔ)，因此菌落是白色的。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。 ? IPTG起誘導(dǎo)表達(dá)的作用，相當(dāng)于乳糖，但它的誘導(dǎo)效率遠(yuǎn)高于乳糖。 α互補(bǔ)法 限制性酶切法 經(jīng)過粗篩后的含重組體的細(xì)菌，還需進(jìn)行限制酶譜分析進(jìn)一步鑒定。將單一細(xì)菌進(jìn)行擴(kuò)增后分別提取其 DNA，用重組時(shí)所用的同一限制酶進(jìn)行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進(jìn)行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。 凝膠電泳檢測(cè) 加樣孔 DNA Marker 空質(zhì)粒 重組質(zhì)粒 重組質(zhì)粒酶切 重組質(zhì)粒的 PCR擴(kuò)增片段 PCR法 利