【文章內容簡介】 以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。 大腸桿菌細胞 大腸桿菌感受態(tài)細胞 得到噬菌斑或單菌落 與重組 DNA共同冰浴 而后 42℃ 短暫熱刺激 CaCl2處理 受體細菌 50100mmol/L CaCl2 感受態(tài)細菌 重組體轉入細菌 轉 化 ? 從 70℃ 冰箱中取 200μl感受態(tài)細胞懸液 ,室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。 ? 加入 pBS質粒 DNA溶液 (含量不超過 50 ng,體積不超過 10μl)，輕輕搖勻，冰上放置 30分鐘后。 ? 42℃ 水浴中熱擊 90秒或 37℃ 水浴 5分鐘，熱擊后迅速置于冰上冷卻 35分鐘。 ? 向管中加入 1ml LB液體培養(yǎng)基 (不含 Amp)，混勻后 37℃ 振蕩培養(yǎng) 1小時，使細菌恢復正常生長狀態(tài) ,并表達質粒編碼的抗生素抗性基因 (Ampr )。 ? 將上述菌液搖勻后取 100μl 涂布于含 Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿 ,37℃ 培養(yǎng) 1624小時。 ? 計算轉化率。 轉化的操作步驟 為了提高轉化效率 , 實驗中要考慮以下幾個重要因素： ? 用于轉化的質粒 DNA應主要是超螺旋態(tài) DNA(cccDNA)。 ? 轉化效率與外源 DNA的濃度在一定范圍內成正比，但當加入的外源 DNA的量過多或體積過大時 ,轉化效率就會降低。 1 ng的 cccDNA即可使 50μl 的感受態(tài)細胞達到飽和。當所轉化的ＤＮＡ很難得時（如用從相對難得的樣品中提取 mRNA而合成的 cDNA),這就顯得格外重要。 ? 一般情況下 ,DNA溶液的體積不應超過感受態(tài)細胞體積的5％。 對照實驗 ? ：在高壓電場下使細胞產生瞬間的穿孔，這個穿孔足夠大并可維持足夠的時間，使外源 DNA進入受體細胞。電穿孔法的轉化效率比鈣轉化法高 2~3個數(shù)量級。這種方法也可用于真核生物的轉染。 轉化方法 真核細胞的轉染 受體細胞系統(tǒng) 永生細胞系 細胞特異性的選擇標記 對抗某種藥物 ? 電穿孔法：原理與原核生物的電穿孔法一樣。 ? 磷酸鈣轉染技術：主要用于動物細胞的轉染。將 DNA溶液加入到 CaCl2中，然后在強烈震蕩下加入由 Na2HPO4和NaH2PO4組成的磷酸緩沖液，使溶液產生磷酸鈣沉淀并將DNA包裹在沉淀中。將這些沉淀加入到細胞中，利用細胞的胞飲作用將 DNA導入到細胞中。磷酸鈣一方面可以增加細胞的通透性，一方面可以避免 DNA被細胞內的核酸酶水解。 磷酸鈣介導的轉染 重組體 + 磷酸鈣微粒 內吞作用 重組體進入細胞 大顆粒 轉染方法 ? 基因槍轉染法： 利用被電場或機械加速的金屬微粒能夠進入細胞內的基本原理，先將 DNA溶液與鎢、金等金屬微粒一起保溫，使 DNA吸附在金屬微粒表面，隨高速的金屬微粒直接進入細胞內。 ? 激光微束穿孔法： 利用直徑很小、能量很高的激光束在細胞表面引起可逆性的穿孔，使 DNA進入細胞。 ? 顯微注射法： 利用毛細管直接將 DNA注入細胞內。 ? 脂質體（ liposome）介導法： 將 DNA包裹在人工制備的磷脂雙分子層的膜狀結構內，通過脂質體與細胞膜的融合而將 DNA導入細胞內。 ? 多聚物介導法： 利用多聚物如 PEG、二乙胺乙基葡聚糖（ DEAE葡聚糖）、多聚賴氨酸、多聚鳥氨酸等與二價陽離子、 DNA混合形成沉淀顆粒，通過細胞的胞飲作用而進入細胞內。 DNA重組的基本模式 分（離目的基因） 切（割目的基因和載體） 接（連目的基因和載體） 轉（化宿主細胞） 篩（選陽性克?。? 表（達目的基因） “縱向”體系 重組體克隆的篩選與鑒定 轉化后的克隆群體： 陽性重組子的 篩選與 鑒定 ? 遺傳檢測法 (根據(jù)重組載體的標志作篩選 ) 插入失活法 α互補法 ? 限制性酶切法 ? PCR法 ? 雜交篩選法 ? 免疫學方 法 ? 核苷酸序列測定法 遺傳檢測法 菌株為某種抗生缺陷型， 而質粒上帶有該抗性基因（如氨芐青霉素， 卡拉霉素等）這樣只有轉化子才能在含該抗生素的培養(yǎng)基上長出。 對于帶有抗藥基因的質粒重組體，可采用 插入滅活法 進行篩選。如 pBR322中帶有抗氨芐青霉素和抗四環(huán)素基因，當將目的基因插入抗四環(huán)素基因后，就可引起該基因失活，細菌對氨芐青霉素耐藥，而對四環(huán)素敏感。在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能夠生長，而在含四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能生長的細菌即為帶重組體的細菌。 如果外源 DNA插入，氨卞青霉素抗性基因失活 如果外源 DNA插入，四環(huán)素抗性基因失活 pBR322質粒結構 pBR322 Amp Tet 插入片段 Amp平板 Tet平板 α互補法 —— 藍白篩選 ? 現(xiàn)在使用的許多載體（如ＰＵＣ系列）有含有一個大腸桿菌ＤＮＡ的短區(qū)段，其中含有 β－半乳糖苷酶基因（ lacZ）的調控序列和 N端１４６個氨基酸偏碼區(qū)（全長 1201氨基酸） 。這個編碼區(qū)中插入一個多克隆位點。 ? 受體菌是 Z基因突變型，只含編碼 β－半乳糖苷酶Ｃ端 aa的序列。當外源基因插入時，在 IPTG （異丙基硫代 βD半乳糖苷）誘導下合成 β－半乳糖苷酶 N端片斷，和受體菌的 C端片斷溶為一體后，可產生蛋白質間的互補，形成有活性的 β－半乳糖苷酶，稱 α互補。 ? 具有 α互補的細菌培養(yǎng)在含 IPTG及 Xgal（ 5溴 4氯 3吲哚 βD半乳糖苷）的培養(yǎng)基上。 Xgal本身是無色的，在半乳糖苷酶的水解下產生蘭色的物質（被水解為無色的半乳糖及深蘭色的 5溴 4氯靛蘭），因此會形成藍色菌落。 ? 而當有外源基因插入到多克隆原點，從而造成插入突變失活，則不能產生 α互補，因此菌落是白色的。通過顏色不同而區(qū)分重組子和非重組子。 ? IPTG起誘導表達的作用，相當于乳糖，但它的誘導效率遠高于乳糖。 α互補法 限制性酶切法 經(jīng)過粗篩后的含重組體的細菌，還需進行限制酶譜分析進一步鑒定。將單一細菌進行擴增后分別提取其 DNA，用重組時所用的同一限制酶進行酶切，再將其與不含目的基因的載體一起進行電泳比較分析，如發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)目的基因片段的電泳帶即證明重組體中帶有目的基因。 凝膠電泳檢測 加樣孔 DNA Marker 空質粒 重組質粒 重組質粒酶切 重組質粒的 PCR擴增片段 PCR法 利