【文章內(nèi)容簡介】 引物 測序引物 定點突變 核酸雜交探針 組織或細胞染色體 DNA 基因片斷 克隆載體 重組 DNA分子 含重組分子的轉(zhuǎn)化菌 限制性內(nèi)切酶 受體菌 基因組 DNA文庫 存在于轉(zhuǎn)化細胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組 DNA的集合 ?從基因組 DNA文庫獲取目的基因 限制酶切位點 限制酶消化 除去中間片段 cos L R cos cos L 左臂 R cos 右臂 真核生物染 色體 DNA 限制酶部分消化 外源 DNA與載體 DNA混合 連接反應 體外包裝 用重組噬菌體 感染大腸桿菌 ~20 Kb DNA 片段 cos L R cos ~20 Kb 外源 DNA 片段 基因文庫 用隨機切割的真核生物染色體 DNA片段構(gòu)建基因文庫 cDNA文庫 將 某一時間某一種類細胞 中所有的 cDNA的混合體與載體進行連接，使每一個 cDNA分子都與一個載體分子拼接成重組 DNA，將所有重組DNA分子引入宿主細胞并進行擴增，得到分子克隆的混合體稱為 cDNA文庫。 mRNA cDNA 雙鏈 cDNA 重組 DNA分子 cDNA文庫 反轉(zhuǎn)錄酶 載體 受體菌 復制 ? 從 cDNA文庫獲取目的基因 逆轉(zhuǎn)錄酶 A A A A T T T T AAAA SI核酸酶 DNA聚合酶 Ⅰ 堿水解 T T T T 聚合酶鏈式反應（ PCR） TA克隆系統(tǒng)由 Invitrogen公司（ San Diego， CA）發(fā)展而來的商業(yè)性試劑盒，它用于 PCR產(chǎn)物的克隆和測序。 其原理是利用 Taq酶能夠在 PCR產(chǎn)物的 3’末端加上一個非模板依賴的 A，而 T載體是一種帶有 3’ T突出端的載體，在連接酶作用下，可以快速地、一步到位地把 PCR產(chǎn)物直接插入到質(zhì)粒載體的多克隆位點（ MCS）中 。 二、載體的選擇與制備 λ噬菌體和粘性質(zhì)粒適用于構(gòu)建基因組文庫， pUC系列等質(zhì)粒適合構(gòu)建 cDNA文庫和克隆一些較小的 DNA片段， M13噬菌體則用于克隆一些待測序的 DNA片段。 選擇載體主要依據(jù)構(gòu)建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。如果構(gòu)建的目的基因是要表達的，則要選擇合適的表達載體。 三、重組體的連接 粘性末端的連接 利用人工接頭連接 加入同聚物尾連接 平端連接 方式： (1)同一限制酶切位點連接 (2)不同限制酶切位點連接 配伍末端連接 非配伍末端連接 1. 粘性末端連接 Bam HⅠ 切割反應 GGATCC CCTAGG T4 DNA連接酶 15186。C GATCC G G CCTAG + 目的基因用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGATCCGGATCCG載體 DNA用 Bam HⅠ 切割 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CG重組體 GCC TA GGCC TA GGA TC CGGA TC CGGCC TAGCC TAGA TC CGGA TC CG載體自連 目的基因自連 同一限制酶切位點連接 不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAGAATT CCT TAAG AGA TCTTC TAGAEco RⅠ 切割位點 Bg lⅡ 切割位點 AA TTC G ATCTA GA ATTCGGATCTAAA TTC G ATCTA G+ EcoRⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 Eco RⅠ + Bg lⅡ 雙酶切 GCTTAAATCTAGA ATTCGGATCTAT4 DNA連接酶 15186。C 重組體 配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。 2. 平端連接 ?限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端 ?粘端補齊或切平形成的平端 適用于： 目的基因 載體 限制性內(nèi)切酶 限制性內(nèi)切酶 T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 載體自連 目的基因 自連 在末端轉(zhuǎn)移酶 (terminal transferase) 的作用下 ， 在 DNA片段末端加上同聚物序列 、 制造出粘性末端 ， 再進行粘端連接 。 3. 同聚物加尾連接 5180。 3180。 3180。 5180。 載體 DNA 5180。 3180。 3180。 5180。 目的基因 限制酶或機械剪切 限制酶 5180。 3180。 3180。 5180。 5180。 3180。 T(T)nT T(T)nT 3180。 5180。 5180。 3180。 3180。 5180。 3180。 A(A)nA A(A)nA 3180。 5180。 λ核酸外切酶 λ核酸外切酶 末端轉(zhuǎn)移酶 + dATP 末端轉(zhuǎn)移酶 + dTTP T4 DNA連接酶 15186。C 重組體 5180。 由平端加上新的酶切位點，再用限制酶切除產(chǎn)生粘性末端，而進行粘端連接 。 4. 人工接頭 (linker)連接 人工接頭及其應用 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5180。 3180。 Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ Eco RⅠ ?受體菌條件： 安全宿主菌 限制酶和重組酶缺陷 處于感受態(tài) (petent) ?導入方式： 轉(zhuǎn)化 (transformation) 轉(zhuǎn)染 (transfection) 感染 (infection) 四、重組 DNA導入受體菌 將重組體 DNA分子導入宿主細胞 轉(zhuǎn)化 指將質(zhì)?；蚱渌庠?DNA導入感受態(tài)的宿主細胞，并使其獲得新的表型的過程。 感染 以 λ噬菌體、粘性質(zhì)粒和真核細胞病毒為載體的重組 DNA分子，在體外經(jīng)過包裝成具有感染能力的病毒或噬菌體顆粒，才能感染適當細胞，并在細胞內(nèi)擴增。 轉(zhuǎn)染 指真核細胞主動攝取或被動導入外源 DNA片段而獲得新的表型的過程。 特殊處理 受體細胞 細胞膜特性改變 CaCl2處理 受體細菌 50100mmol/L CaCl2 感受態(tài)細菌 重組體轉(zhuǎn)入 細菌 直接選擇法 (1) 抗藥性標記選擇 (2) 標志補救 (marker rescue) (3) 分子雜交法 原位雜交 Southern印跡 免疫學方法 如免疫化學方法及酶免檢測分析等 五、重組體的篩選 轉(zhuǎn)化后的克隆群體 ： 采用遺傳學方法篩選特定的重組 DNA (1) 抗藥性標記選擇 (2) 標志補救 (marker rescue) (插入失活法) 抗藥性標記選擇 目 錄 組氨酸缺陷 型大腸桿菌 無組氨酸 的培養(yǎng)基 酵母咪唑甘油磷 酸脫水酶基因 促進組氨酸合成 λDNA 重組體 標志補救 目 錄 若克隆基因的表