基因工程載體(編輯修改稿)
2025-01-25 17:57 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 部分 ：一部分缺少 E組份 ，另一部分則 缺少 D組份 。包裝時(shí)，當(dāng)且僅當(dāng)這兩部分包裝蛋白與重組 lDNA分子混合后，包裝才能有效進(jìn)行，任何一種蛋白包裝液被重組 lDNA污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設(shè)計(jì)的。lDNA及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期 加入 l噬菌體或重組 l噬菌體的懸浮液， 37℃ 培養(yǎng) 1小時(shí) 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng) 4 12小時(shí)。這時(shí)噬菌體顆粒密度已達(dá) 1013 1014 / L，大腸桿菌細(xì)胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放 lDNA乙醇或異丙醇沉淀 lDNAlDNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：lDNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 lDNA載體的裝載能力為 25 kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量 重組 lDNA分子 的篩選較為方便 重組 lDNA分子的提取較為簡(jiǎn)便 lDNA載體適合克隆和擴(kuò)增外源 DNA片段，但不適合表達(dá)外源基因常用的 λ噬菌體衍生載體載體名稱 分子大小 (kb)可克隆外源 DNA片段大小 (kb)Charon3A0–Charon4A 0–Charon170Charon200–Charon21A0–Charon280–Charon300LA7–10–Sep6lac50–BF10146.0– cosmid 克隆載體n 1978年 Collins和 Hohn構(gòu)建一種新型的大腸桿菌克隆載體，命名為 cosmid（柯斯質(zhì)粒）， 又叫 粘粒 。n 柯斯質(zhì)粒（ cosmid） =cos序列 +質(zhì)粒。實(shí)際是質(zhì)粒的衍生物，它是用正常的質(zhì)粒同 l噬菌體的 cos位點(diǎn)構(gòu)成。n 可在細(xì)菌中保存和大量復(fù)制?？滤官|(zhì)粒載體 pJB8柯斯質(zhì)粒載體 pHC79由 pBR322質(zhì)粒 DNA與噬菌體 DNA的 cos位點(diǎn)及其控制包裝作用的序列構(gòu)成部分 cosmid克隆載體的基本性質(zhì)Cosmid克隆載體的組成及性質(zhì)n 大小一般 5~24kb，高容量的克隆能力，可以容納40~50kb的插入片段。① 具有 l噬菌體的特性② 具有質(zhì)粒載體的特性 （有質(zhì)粒復(fù)制子及抗菌素基因）③ 具有高容量的克隆能力④ 具有與含同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力cosmid克隆載體的流程圖切割體系（ sitespecificcuttingsystem） 末端酶或 Ter體系M13噬菌體克隆載體n M13噬菌體的特點(diǎn)*環(huán)狀單鏈 DNA(6407堿基 ),可轉(zhuǎn)導(dǎo) *含有基因間隔區(qū) (ISIntersequence)*具有轉(zhuǎn)染作用 ()M13DNA的復(fù)制與 M13噬菌體的增殖 a)M13噬菌體吸附在大腸桿菌表面 F性纖毛上 ,M13ssDNA(+鏈 )進(jìn)入細(xì)胞。b)在宿主細(xì)胞內(nèi)以 +鏈為模板合成大量的 DNA鏈 ,成為雙鏈復(fù)制型 DNA(RFDNA),同時(shí)在宿主細(xì)胞內(nèi)合成大量的 特異性蛋白與 +鏈 DNA結(jié)合 。c)RFDNA以 DNA為模板不斷合成 +鏈 DNA,與特異性蛋白結(jié)合，組裝成新的噬菌體顆粒。釋放到細(xì)胞外，而不破壞宿主細(xì)胞。RFDNA一對(duì) M13克隆載體 M13mp18和 M13mp19的結(jié)構(gòu)圖M13克隆載體分子結(jié)構(gòu)圖 外源 DNA片段在M13噬菌體載體上的定向克隆M13噬菌體克隆載體的優(yōu)點(diǎn)n M13的感染與釋放不會(huì)殺死宿主菌，僅導(dǎo)致宿主菌生長(zhǎng)緩慢。n M13DNA在宿主菌內(nèi)既可以是單鏈也可以是雙鏈。n M13的包裝不受 DNA大小的限制，其噬菌體顆粒的大小可隨 DNA的大小而改變，即使 DNA的大小比本身 DNA的大小超出 6倍，仍能進(jìn)行包裝。n M13的基因組中除有一段 507個(gè)核苷酸，其余都含有與其復(fù)制有關(guān)的遺傳信息。因此，只有在這一段中可插入外源DNA而不致影響噬菌體的活性。插入 M13的外源 DNA超1000bp時(shí)就不穩(wěn)定，在噬菌體增殖時(shí)會(huì)出現(xiàn)缺失。一般說(shuō)， 插入 300~400bp時(shí)相當(dāng)穩(wěn)定的 。大分子 DNA克隆載體細(xì)菌人工染色體載體酵母人工染色體載體 1992年在大腸桿菌的 F因子（大小約100kb）的基因礎(chǔ)上構(gòu)建。F質(zhì)粒的特點(diǎn)：n 單拷貝復(fù)制n 克隆容量可達(dá) 300kbn 比較穩(wěn)定每細(xì)胞只有一個(gè)拷貝，不會(huì)重組。n 便于提純像提取質(zhì)粒一樣直接提純細(xì)菌人工染色體載體(bacterialartificialchromosome,BAC)n oriS和 repE控制質(zhì)粒的單向復(fù)制n parA和 parB維持低水平質(zhì)?？截悢?shù)n HindⅢ 和 BamHⅠ 是插入位點(diǎn)n 兩側(cè)的 NotⅠ 可
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