基因工程ii-外源基因的表達(dá)(ppt62)(1)(編輯修改稿)
2025-03-31 20:41 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 型表達(dá) 優(yōu)點(diǎn)： ● 目的蛋白穩(wěn)定性高 ● 目的蛋白易于分離 ● 目的蛋白末端完整 ● 有利于目的蛋白形成正確的空間構(gòu)象 缺點(diǎn)： ● 表達(dá)量低 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 分泌型表達(dá) 系統(tǒng)的構(gòu)建 ： 在目的基因 N端加入大腸桿菌 信號(hào)肽序列 ， 轉(zhuǎn)化完全分泌型受體細(xì)胞 。 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 融合型表達(dá) 外源基因的表達(dá)形式 定義： 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起 ， 但不改變兩個(gè)基因閱讀框 ，以目的蛋白和受體菌蛋白融合形式表達(dá)目的蛋白 。 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 融合型表達(dá) 優(yōu)點(diǎn)： ● 目的蛋白穩(wěn)定性高 ● 目的蛋白易于分離 ● 目的蛋白表達(dá)率高 ● 目的蛋白溶解性好 缺點(diǎn)： ● 裂解和進(jìn)一步分離 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 融合型表達(dá) 構(gòu)建原則： ● 高效表達(dá) ● 外源基因的位置 ● 兩個(gè)結(jié)構(gòu)基因拼接位點(diǎn)處序列的設(shè)計(jì) ● 保持一致的翻譯閱讀框架 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 融合型表達(dá) 受體蛋白 ： ● 谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（ GST） ● 硫氧化還原蛋白（ TrxA） ● 麥芽糖結(jié)合蛋白（ MBP） ● 金黃色葡萄球菌蛋白 A（ SAPA） ● 外膜蛋白（ OmpF） ● 泛素蛋白（ Ubi） ● 半乳糖苷酶（ LacZ） （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 融合型表達(dá) 蛋白質(zhì)回收 ： 融合蛋白的位點(diǎn)專一性斷裂方法 化學(xué)斷裂法 單殘基位點(diǎn) 多殘基位點(diǎn) 酶促裂解法 目的 蛋白 載體 蛋白 多 克 隆 酶切位點(diǎn) 切割 位點(diǎn) （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 寡聚型表達(dá) 外源基因的表達(dá)形式 定義： 將多拷貝的外源基因克隆在一個(gè)低拷貝質(zhì)粒上 ， 以獲得目的蛋白的高效表達(dá) 。 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 寡聚型表達(dá) 優(yōu)點(diǎn)： ● 目的蛋白高效表達(dá) ● 穩(wěn)定表達(dá)小分子短肽 缺點(diǎn)： ● 目的產(chǎn)物回收困難 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 不穩(wěn)定性形式 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策 ● 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定性 ● 分配不穩(wěn)定性 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 機(jī) 制 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策 ● 限制修飾 ● 應(yīng)急反應(yīng) ● 重組質(zhì)粒的不均勻分配 ● 受體細(xì)胞內(nèi)源性的轉(zhuǎn)座元件的作用 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達(dá) ◆ 改進(jìn)策略 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對(duì)策 ● 改進(jìn)載體受體系統(tǒng) ● 施加選擇壓力 ● 控制目的基因的過(guò)量表達(dá) ● 改進(jìn)培養(yǎng)工藝 （二） 外源基因在酵母菌中的表達(dá) 受體菌的特征 酵母菌的宿主系統(tǒng) 酵母菌的轉(zhuǎn)化系統(tǒng) 酵母菌的表達(dá)系統(tǒng) （二） 外源基因在酵母菌中的表達(dá) 酵母菌（ Yeast）是一群以 芽殖 或 裂殖 方式進(jìn)行 無(wú)性繁殖 的 單細(xì)胞真核生物 ，共由 56個(gè)屬和500多個(gè)種。 酵母菌的分類學(xué)特征 酵母菌是最成熟的真核生物表達(dá)系統(tǒng) （二） 外源基因在酵母菌中的表達(dá) 全基因組測(cè)序，遺傳操作簡(jiǎn)便 優(yōu)勢(shì) 可分泌表達(dá)產(chǎn)物至培養(yǎng)基中
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