基因工程ii-外源基因的表達(ppt62)(1)(編輯修改稿)
2025-03-31 20:41 本頁面
【文章內容簡介】 型表達 優(yōu)點： ● 目的蛋白穩(wěn)定性高 ● 目的蛋白易于分離 ● 目的蛋白末端完整 ● 有利于目的蛋白形成正確的空間構象 缺點： ● 表達量低 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 分泌型表達 系統(tǒng)的構建 ： 在目的基因 N端加入大腸桿菌 信號肽序列 ， 轉化完全分泌型受體細胞 。 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 融合型表達 外源基因的表達形式 定義： 將外源蛋白基因與受體菌自身蛋白基因重組在一起 ， 但不改變兩個基因閱讀框 ，以目的蛋白和受體菌蛋白融合形式表達目的蛋白 。 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 融合型表達 優(yōu)點： ● 目的蛋白穩(wěn)定性高 ● 目的蛋白易于分離 ● 目的蛋白表達率高 ● 目的蛋白溶解性好 缺點： ● 裂解和進一步分離 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 融合型表達 構建原則： ● 高效表達 ● 外源基因的位置 ● 兩個結構基因拼接位點處序列的設計 ● 保持一致的翻譯閱讀框架 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 融合型表達 受體蛋白 ： ● 谷胱甘肽轉移酶（ GST） ● 硫氧化還原蛋白（ TrxA） ● 麥芽糖結合蛋白（ MBP） ● 金黃色葡萄球菌蛋白 A（ SAPA） ● 外膜蛋白（ OmpF） ● 泛素蛋白（ Ubi） ● 半乳糖苷酶（ LacZ） （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 融合型表達 蛋白質回收 ： 融合蛋白的位點專一性斷裂方法 化學斷裂法 單殘基位點 多殘基位點 酶促裂解法 目的 蛋白 載體 蛋白 多 克 隆 酶切位點 切割 位點 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 寡聚型表達 外源基因的表達形式 定義： 將多拷貝的外源基因克隆在一個低拷貝質粒上 ， 以獲得目的蛋白的高效表達 。 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 寡聚型表達 優(yōu)點： ● 目的蛋白高效表達 ● 穩(wěn)定表達小分子短肽 缺點： ● 目的產(chǎn)物回收困難 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 不穩(wěn)定性形式 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策 ● 結構不穩(wěn)定性 ● 分配不穩(wěn)定性 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 機 制 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策 ● 限制修飾 ● 應急反應 ● 重組質粒的不均勻分配 ● 受體細胞內源性的轉座元件的作用 （一）外源基因在大腸桿菌中的表達 ◆ 改進策略 基因工程菌的遺傳不穩(wěn)定性及其對策 ● 改進載體受體系統(tǒng) ● 施加選擇壓力 ● 控制目的基因的過量表達 ● 改進培養(yǎng)工藝 （二） 外源基因在酵母菌中的表達 受體菌的特征 酵母菌的宿主系統(tǒng) 酵母菌的轉化系統(tǒng) 酵母菌的表達系統(tǒng) （二） 外源基因在酵母菌中的表達 酵母菌（ Yeast）是一群以 芽殖 或 裂殖 方式進行 無性繁殖 的 單細胞真核生物 ，共由 56個屬和500多個種。 酵母菌的分類學特征 酵母菌是最成熟的真核生物表達系統(tǒng) （二） 外源基因在酵母菌中的表達 全基因組測序，遺傳操作簡便 優(yōu)勢 可分泌表達產(chǎn)物至培養(yǎng)基中
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