基因工程技術(shù)與應(yīng)用知識點(diǎn)(編輯修改稿)
2024-09-01 04:40 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 (BAC)、源于噬菌體P1的人工染色體(PAC)，它們的特點(diǎn)是載體的容載能力擴(kuò)大,人工染色體具備三個(gè)元件：復(fù)制起始區(qū)/自主復(fù)制序列，參與染色體DNA復(fù)制起始結(jié)構(gòu)的形成；著絲粒，負(fù)責(zé)染色體向子細(xì)胞傳遞。端粒, 對染色體DNA兩個(gè)末端起封口和保護(hù)作用。λDNA作為載體的優(yōu)點(diǎn)：1) λDNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌；2) λDNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于質(zhì)粒的裝載量；3) 重組λDNA的篩選較為方便, 可進(jìn)行正向篩選和雜交篩選；4) 重組λDNA分子的提取比質(zhì)粒容易PCR反應(yīng)體系的成份：Taq酶、模板DNA、引物、dNTP、PCR 緩沖液PCR反應(yīng)的步驟：①DNA變性：（90℃96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。②退火：（60℃65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。③延伸：（70℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈。探針：具有一定序列的核苷酸片段，能與互補(bǔ)的核酸序列復(fù)性雜交，并且能通過適當(dāng)標(biāo)記進(jìn)行檢測。目的基因。是指已被或欲被分離、改造、擴(kuò)增和表達(dá)的特定基因或DNA片段。基因文庫：是某種特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合cDNA文庫。以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDNA文庫。構(gòu)建步驟：分離純化總RNA及mRNA；?cDNA第一鏈的合成?雙鏈cDNA合成?與載體重組、轉(zhuǎn)化基因組文庫：某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個(gè)受體菌的群體中，這個(gè)群體即為這種生物的基因組文庫。探針雜交原理。任意兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對的趨勢。但形成的大多數(shù)分子對由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。如果多聚核苷酸鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的，堿基對的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。原位雜交技術(shù)：基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補(bǔ)的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細(xì)胞或染色體上待測DNA或RNA互補(bǔ)配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細(xì)胞或染色體上的位置顯示出來。cDNA文庫的構(gòu)建步驟：分離純化總RNA及mRNA（P104110）、cDNA第一鏈的合成、雙鏈cDNA合成、與載體重組、轉(zhuǎn)化從基因文庫中獲取目的基因的方法：PCR法、化學(xué)合成法、分離目的基因的方法和原理：1從生物基因組群體中分離目的基因（原核生物基因組較小,基因容易定位,用限制性內(nèi)切酶將基因組切成若干段后,用帶有標(biāo)記的核酸探針,.）2人工合成目的基因DNA片段（.
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