基因工程技術(shù)與應用知識點(編輯修改稿)
2024-09-01 04:40 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 (BAC)、源于噬菌體P1的人工染色體(PAC)，它們的特點是載體的容載能力擴大,人工染色體具備三個元件：復制起始區(qū)/自主復制序列，參與染色體DNA復制起始結(jié)構(gòu)的形成；著絲粒，負責染色體向子細胞傳遞。端粒, 對染色體DNA兩個末端起封口和保護作用。λDNA作為載體的優(yōu)點：1) λDNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌；2) λDNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量；3) 重組λDNA的篩選較為方便, 可進行正向篩選和雜交篩選；4) 重組λDNA分子的提取比質(zhì)粒容易PCR反應體系的成份：Taq酶、模板DNA、引物、dNTP、PCR 緩沖液PCR反應的步驟：①DNA變性：（90℃96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下，氫鍵斷裂，形成單鏈DNA。②退火：（60℃65℃）：系統(tǒng)溫度降低，引物與DNA模板結(jié)合，形成局部雙鏈。③延伸：（70℃75℃）：在Taq酶（在72℃左右，活性最佳）的作用下，以dNTP為原料，從引物的3′端開始以從5′→3′端的方向延伸，合成與模板互補的DNA鏈。探針：具有一定序列的核苷酸片段，能與互補的核酸序列復性雜交，并且能通過適當標記進行檢測。目的基因。是指已被或欲被分離、改造、擴增和表達的特定基因或DNA片段?；蛭膸欤菏悄撤N特定的生物所含有的能夠包含所有基因的足夠數(shù)目的克隆的集合cDNA文庫。以mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA片段分別與克隆載體重組，貯存在一種受體菌群體中，這樣的群體稱為cDNA文庫。構(gòu)建步驟：分離純化總RNA及mRNA；?cDNA第一鏈的合成?雙鏈cDNA合成?與載體重組、轉(zhuǎn)化基因組文庫：某種生物的基因組的全部遺傳信息通過克隆載體貯存在一個受體菌的群體中，這個群體即為這種生物的基因組文庫。探針雜交原理。任意兩條單鏈核酸分子都有相互形成堿基對的趨勢。但形成的大多數(shù)分子對由于只有少數(shù)鏈間氫鍵形成，雜交結(jié)構(gòu)并不穩(wěn)定。如果多聚核苷酸鏈是互補的，堿基對的大量形成使雙鏈分子穩(wěn)定。原位雜交技術(shù)：基本原理是利用核酸分子單鏈之間有互補的堿基序列，將有放射性或非放射性的外源核酸(即探針)與組織、細胞或染色體上待測DNA或RNA互補配對，結(jié)合成專一的核酸雜交分子，經(jīng)一定的檢測手段將待測核酸在組織、細胞或染色體上的位置顯示出來。cDNA文庫的構(gòu)建步驟：分離純化總RNA及mRNA（P104110）、cDNA第一鏈的合成、雙鏈cDNA合成、與載體重組、轉(zhuǎn)化從基因文庫中獲取目的基因的方法：PCR法、化學合成法、分離目的基因的方法和原理：1從生物基因組群體中分離目的基因（原核生物基因組較小,基因容易定位,用限制性內(nèi)切酶將基因組切成若干段后,用帶有標記的核酸探針,.）2人工合成目的基因DNA片段（.
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