【文章內(nèi)容簡介】 ） DNA模板與引物復(fù)性 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ 3’ ACGTACGTA 5’ 3’ 引物 引物 引物（ primer） : 4065oC DNA聚合酶按堿基配對原則在模板上延伸 DNA鏈。 （ 3） DNA鏈的延伸 TGCATGCAT ATCTTGAAC 3’ 5’ 5’ TAGAACTTG ACGTACGTA 3’ 模板 模板 ATCTTGAAC 5’ ACGTACGTA 5’ Taq Taq 72oC 理論上 2530次循環(huán)就可以合成 225230條 DNA。 變性 — 復(fù)性 — 延伸。 （ 4） 1個循環(huán)的結(jié)果 （ 5）新一輪循環(huán)開始 3. PCR的過程 （ 1）第一步 變性（ denature） 9495 oC下 5分鐘，模板 DNA雙鏈完全變性成單鏈。 在 : 10 PCR緩沖液 5181。l； MgCl２ 3181。l； dNTP 4181。l； 引物 1, 2181。l； TaqDNA聚合酶 引物 2 , 2181。l； HaSNPV基因組 DNA 1181。l； ddH２ O補至 50181。l。 加礦物油 30ul于反應(yīng)混合物表面，以防止加溫過程中液體蒸發(fā)。 94 oC下 1分鐘，新合成的 DNA雙鏈又變性成單鏈模板。 （ 4）第四步 變性（ denature） 72 oC下 12分鐘， Taq DNA聚合酶在引物的3‘端上加上核苷酸。 （ 3）第三步 延伸（ extend） （ 5）第五步 重復(fù)（ repeat） ① 引物的濃度高， ② 引物的鏈短。 5060 oC下 1分鐘，引物優(yōu)先與模板復(fù)性。 （ 2）第二步 復(fù)性（ anneal） ? 5‘ ? 5‘ ? 目的基因 ? 5‘ ? 變性 ? 加熱 ? 5‘ ? 5‘ ? 引物 ? 退火 ? 5‘ ? 5‘ ? 底物 ? 聚合 ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 加熱 ? 變性 ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 5‘ ? 退火 引物 ? 底物 ? 聚合 ? 加熱 ? 變性 ? 引物 ? 退火 ? 底物 ? 聚合 需要的模板量極低。 （ 1）特異性強 ① PCR使用專門合成的 DNA引物 。 ② 延伸過程是在 高溫 下進行。 （ 2）敏感性高 這就避免了一般 DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的 DNA。提高了反應(yīng)的特異性。 理論上只要一條模板鏈， 32次循環(huán)就可合成約 109條！ 4. PCR的特點 RTPCR： 對模板的純度要求低。 （ 5）可以擴增 mRNA （ 4）簡便 先用 逆轉(zhuǎn)錄酶 將 mRNA合成 cDNA，再以 cDNA為模板進行擴增。 （ 3）快速 整個 PCR過程約 4小時即可完成。 不需要純化，甚至可以直接用細菌。已固定或包埋的組織切片也可以直接用于作模板。 自從 . Erilish分離出耐高溫的 Taq DNA聚合酶，代替大腸桿菌 DNA聚合酶 Klenow片斷（ 37 oC )，PCR技術(shù)才進入實用階段。 （ 1） Taq DNA聚合酶 5. 影響 PCR的因素 Taq DNA聚合酶的最大特點是 熱穩(wěn)定性 ，耐高溫，非常適合 PCR過程的反復(fù)高溫變性要求。 ① 熱穩(wěn)定性 最適溫度： 7580 oC 最長延伸長度： ② 最適溫度高 ③ Taq酶的功能缺點 具有 5’?3’聚合酶活性和 5’?3’外切酶活性，但沒有 3‘?5’外切酶活性。 因此不能修復(fù)錯誤的堿基配對！ 合成超過 600bp長度的 DNA就有可能出現(xiàn)錯配，一般 PCR中出錯率為 2 104 核苷酸 /每輪循環(huán)。用于克隆基因時必須測序。 , 金屬離子敏感（尤其是 Mg2+ ）。 當 dNTP（能結(jié)合 Mg2+）的濃度為 時， MgCl2的最佳濃度應(yīng)是 。 ④ Taq DNA聚合酶的激活劑 50mmol/L KCl也能激活 Taq DNA聚合酶的活性。 Taq的 PCR產(chǎn)物 3’端往往帶有一個 A。 （ 2）其它耐熱的 DNA聚合酶 ① Tth DNA聚合酶 無 3’ ? 5’DNA外切酶活性，但高溫下能 逆轉(zhuǎn)錄 cDNA，又能擴增 DNA。 ② VENT DNA聚合酶 有 3‘?5’外切酶活性，能夠校正堿基的錯配。能耐受 100oC高溫 。 ③ Pfu DNA Polymerase ④ Taq Plus DNA Polymerase 有 3 ’5’的外切酶活性， 5’3’外切酶活性。 但 PCR產(chǎn)物為平端！ 是目前已發(fā)現(xiàn)的所有耐高溫 DNA 聚合酶中出錯率最低的。 是 Taq和 Pfu DNA聚合酶的混合物。 與待擴增的模板 DNA區(qū)段的兩 3’端序列互補（ 5‘端相同）的短 DNA。 （ 3）引物（ primer) ① 位置 3’ 3’ ② 引物的長度 一般引物設(shè)計為長 15— 30bp。 太短會降低退火溫度影響引物與模板配對，從而使非特異性增高。太長則比較浪費 ,且難以合成 ③ 引物的堿基序列 5’端根據(jù)需要可設(shè)計成某個 內(nèi)切酶的切點 順序、RNA聚合酶識別序列、突變位點或生物素標記等，方便與以后操作。 5’ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3’ 3’GCTAGCTACTTAAG5’ 3‘端必須與模板正確配對， 5’端可以不配對。 template primer 盡可能提高 G+C含量 ，以提高引物與模板的結(jié)合力， G+C含量通常為 40%60% ④ 引物的堿基組成 避免 連續(xù)相同堿基 排列或內(nèi)部 回文序列 . 5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’ CTGCCAGTCTAC3’ GACGG5’ T 發(fā)卡結(jié)構(gòu) 1） 2） 3）避免 形成引物二聚體（ dimer） 兩個引物之間不能有兩個以上的連續(xù)堿基序列互補。 5’GGTCTGCCAGTCTAC3’ 3’CAGGACTTAGTCACT5’ primer1 primer2 ⑤ 引物的 Tm值 Tm=（ G+C)?4 + (A+T)?2 當引物中的（ G+C）含量低于 50%時，復(fù)性溫度低于 55 oC。 適當提高復(fù)性溫度可以提高引物與模板結(jié)合的特異性，減少非特異產(chǎn)物的出現(xiàn)。 實際復(fù)性溫度選擇 低于 Tm值 5 oC。 手工計算： 一般估計： ⑥ 引物的濃度 一般使用終濃度各 ?mol/L。 ⑦ 簡并引物 如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的 氨基酸序列反推出來的 ，就必須考慮密碼的 簡并性 。 需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。 設(shè)計 多組引物 ，結(jié)合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。 引物設(shè)計現(xiàn)在多用專業(yè)軟件 如 ⑧ 套嵌引物（ nested primers) 1 3 2 4 但不能有 蛋白質(zhì)變性劑、 DNA酶、 Mg2+的螯合劑等影響 DNA聚合酶的活性。 ② 模板的量： 不能太多， 100?l反應(yīng)體系中 100ng足夠。 ① 純度： PCR對模板 DNA的純度要求不高。 （ 4）模板（ template) dNTPs 是 dATP、 dTTP、 dCTP和 dGTP的總稱。 （ 5） dNTPs 一般反應(yīng)體系中 dNTP混合液終濃度用。 濃度過高會抑制 Taq DNA聚合酶的活性并增加錯配率。 Taq DNA聚合酶要求有游離的 Mg2