基因工程基本操作過(guò)程(編輯修改稿)
2025-01-25 17:52 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 分子間碰撞機(jī)會(huì)； ? ③加入 10% PEG8000，促進(jìn)大分子之間的有效作用； ? ④加入單價(jià)陽(yáng)離子（ NaCl）。 ? 當(dāng)載體和外源 DNA片段兩端的酶切位點(diǎn)之間，不可能 找到恰當(dāng)?shù)钠ヅ鋾r(shí)，解決方法： ? ⑴ 人工接頭連接法 ：通過(guò)依次加入、連接合成 DNA接 頭，再用限制酶切加以解決。 ? ⑵ 同聚物加尾連接法 ：可以利用末端轉(zhuǎn)移酶分別在 載體酶切位點(diǎn)處和外源 DNA片段的 3’端加上相互補(bǔ) 的同聚尾加以解決。 ?⑶ PCR法 ：通過(guò) PCR(聚合酶鏈反應(yīng) )技術(shù)擴(kuò)增外源 DNA 片段，從而加上合適的限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別序 列，再用限制酶切加以解決。 ? 同聚物加尾連接：利用末端轉(zhuǎn)移酶在載體及外源雙鏈 DNA的 3′端各加上一段寡聚核苷酸，制成人工粘性末端，外源 DNA和載體 DNA分子要分別加上不同的寡聚核苷酸 。 dA(dG)和 dT(dC), 然后在 DNA連接酶的作用下 , 連接成為重組的 DNA。這種方法可適用于任何來(lái)源的 DNA片段。 ? 但方法較繁，需要 λ核酸外切酶、 S1核酶、末端轉(zhuǎn)移酶等協(xié)同作用 。 ?同聚物接尾法實(shí)際上是一種人工粘性末端連接法 。 ? 優(yōu)點(diǎn) ：通過(guò) DNA加尾，既可以使兩個(gè)具平末端的 DNA片段進(jìn)行連接，也可以使具平末端的DNA片段與粘性末端的 DNA片段進(jìn)行連接。 ? 缺點(diǎn) ：只對(duì)質(zhì)粒載體有效；質(zhì)粒和 cDNA上的同聚物長(zhǎng)度難以控制相等，影響克隆效率；用其轉(zhuǎn)化宿主菌的效率依不同菌株而有較大差異。 ? 人工接頭（ DNA寡核苷酸連桿） 是人工合成的具有一個(gè)或數(shù)個(gè)特定 限制性內(nèi)切酶識(shí)別和切割序列的雙股平端 DNA 短序列。 由平端加上新的酶切位點(diǎn)，再用限制酶切除產(chǎn) 生粘性末端，而進(jìn)行粘端連接 。 ? 優(yōu)點(diǎn) ：是進(jìn)行 DNA重組的一種既有效又實(shí)用的手段，兼具有同聚物加尾法和粘性末端連接法的優(yōu)點(diǎn)，而且它可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)的不同要求，設(shè)計(jì)出具有不同限制酶位點(diǎn)的人工接頭。若在體外連接反應(yīng)中增加人工接頭的濃度，還會(huì)大大提高平末端DNA片段間的連接效率。 ? 缺點(diǎn) ：如果待克隆的 DNA片段或基因的內(nèi)部，也含有與所加的人工接頭相同的限制酶切位點(diǎn)，這樣在酶切消化人工接頭產(chǎn)生粘性末端的同時(shí)，也會(huì)把克隆的外源基因切成不同的片段，從而為后繼的操作造成麻煩。 ? 自從 1973 年 Jackson 等人在一次分子生物學(xué)學(xué)會(huì)上首次提出基因可以人工重組，并能在細(xì)菌中復(fù)制。從此以后，基因工程成為一項(xiàng)新興的研究領(lǐng)域得到了迅速的發(fā)展，無(wú)論是基礎(chǔ)研究，還是應(yīng)用研究均取得了喜人的成果。這是生命科學(xué)發(fā)展的一次飛躍，生命科學(xué)已經(jīng)進(jìn)入了一個(gè)定向、快速改造生物性狀的新時(shí)代，受到了國(guó)內(nèi)外廣泛的重視。 ? 開
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