基因工程的基本操作程序新(編輯修改稿)
2024-10-08 21:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 萬倍地擴增 模板 DNA 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 ? 過程： 變性、退火、延伸三步曲 ?變性： 加熱至 90～95℃ 雙鏈 DNA解鏈成為單鏈 DNA ?退火： 冷卻至 55～60℃ 引物與模板的單鏈 DNA的特定互補部位配對并結(jié)合 ?延伸： 加熱至 70～75℃ 以目的基因為模板，在 DNA聚合酶催化下，從引物開始延伸，合成互補的新 DNA鏈 變性 退火 延伸 Taq DNA聚合酶 (thermus aquaticus) 酶活性(%) 溫度 (℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 美國黃石公園的熱泉 當然，除了 Taq，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)了其他多種多樣的耐高溫的 DNA多聚酶 PCR的基本反應步驟 變性 9095?C 延伸 7075?C 退火 5560?C 整個過程可以在PCR儀中自動完成 循環(huán)30輪左右 PCR管 PCR技術(shù)擴增與 DNA復制的比較 PCR技術(shù) DNA復制 相同點 原理 原料 條件 不同點 解旋方式 場所 酶 結(jié)果 堿基互補配對 四種脫氧核苷酸 模板、酶、 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化 體外復制 細胞核內(nèi) 熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶 細胞內(nèi)的 DNA聚合酶 大量的 DNA片段 形成整個 DNA分子 能量、引物 （ 3)人工合成 DNA測序； 根據(jù)已知的氨基酸序列推測 DNA序列； 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測 推測 目的基因 化學合成 DNA合成儀 (一般用于目的基因比較小，且序列又已知 ) 思考： 人工合成的目的基因 和 真正的基因 之間的序列是否是完全一致的？ 二、基因表達載體的構(gòu)建 —— 基因工程的 核心 目的： 使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代 ，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 基因表達載體需要哪些結(jié)構(gòu)呢？ 實際上就是 目的基因 和 運載體 結(jié)合的過程 基因表達載體的組成： 復制原點 +目的基因 +啟動子 +終止子 +標記基因 它們各自的作用是什么 ? 啟動子： 位于基因的首端的一段特殊的 DNA片斷，它是RNA聚合酶 識別和結(jié)合的部位，有了它才能 驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出 mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子： 位于基因的尾端的一段特殊的 DNA片斷， 能終止 mRNA的轉(zhuǎn)錄 標記基因： 鑒別 受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細胞篩選出來 ① 載體 與 表達載體 的區(qū)別：表達載體在載體基礎(chǔ)上增加了 目的基因 、啟動子、終止子三部分結(jié)構(gòu) （ 在限制酶切割位點上插入 ） 。 ② 用到的 工具酶 ： 既用到 限制酶 切割載體、目的基因，又用到 DNA連接酶 將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學鍵都是磷酸二酯鍵。 ③ 啟動子、終止子 對于目的基因的表達必不可少。 ④ 目的基因不能單獨進入受體細胞， 必需以表達載體的方式攜帶進去。 基因表達載體的構(gòu)建過程： 載體 目的基因、 啟動子、終止子 等元件 限制酶切割 DNA連接酶連接 基因表達載體 科學家在培育抗蟲棉
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