基因工程的基本操作程序新(編輯修改稿)
2024-10-08 21:09 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 萬倍地?cái)U(kuò)增 模板 DNA 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 ? 過程： 變性、退火、延伸三步曲 ?變性： 加熱至 90～95℃ 雙鏈 DNA解鏈成為單鏈 DNA ?退火： 冷卻至 55～60℃ 引物與模板的單鏈 DNA的特定互補(bǔ)部位配對(duì)并結(jié)合 ?延伸： 加熱至 70～75℃ 以目的基因?yàn)槟０?，?DNA聚合酶催化下，從引物開始延伸，合成互補(bǔ)的新 DNA鏈 變性 退火 延伸 Taq DNA聚合酶 (thermus aquaticus) 酶活性(%) 溫度 (℃) 40 50 60 70 80 90 100 100 80 60 40 20 美國(guó)黃石公園的熱泉 當(dāng)然，除了 Taq，現(xiàn)在還發(fā)現(xiàn)了其他多種多樣的耐高溫的 DNA多聚酶 PCR的基本反應(yīng)步驟 變性 9095?C 延伸 7075?C 退火 5560?C 整個(gè)過程可以在PCR儀中自動(dòng)完成 循環(huán)30輪左右 PCR管 PCR技術(shù)擴(kuò)增與 DNA復(fù)制的比較 PCR技術(shù) DNA復(fù)制 相同點(diǎn) 原理 原料 條件 不同點(diǎn) 解旋方式 場(chǎng)所 酶 結(jié)果 堿基互補(bǔ)配對(duì) 四種脫氧核苷酸 模板、酶、 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化 體外復(fù)制 細(xì)胞核內(nèi) 熱穩(wěn)定的 DNA聚合酶 細(xì)胞內(nèi)的 DNA聚合酶 大量的 DNA片段 形成整個(gè) DNA分子 能量、引物 （ 3)人工合成 DNA測(cè)序； 根據(jù)已知的氨基酸序列推測(cè) DNA序列； 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 推測(cè) 推測(cè) 目的基因 化學(xué)合成 DNA合成儀 (一般用于目的基因比較小，且序列又已知 ) 思考： 人工合成的目的基因 和 真正的基因 之間的序列是否是完全一致的？ 二、基因表達(dá)載體的構(gòu)建 —— 基因工程的 核心 目的： 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代 ，同時(shí)使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 基因表達(dá)載體需要哪些結(jié)構(gòu)呢？ 實(shí)際上就是 目的基因 和 運(yùn)載體 結(jié)合的過程 基因表達(dá)載體的組成： 復(fù)制原點(diǎn) +目的基因 +啟動(dòng)子 +終止子 +標(biāo)記基因 它們各自的作用是什么 ? 啟動(dòng)子： 位于基因的首端的一段特殊的 DNA片斷，它是RNA聚合酶 識(shí)別和結(jié)合的部位，有了它才能 驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出 mRNA，最終獲得蛋白質(zhì) 終止子： 位于基因的尾端的一段特殊的 DNA片斷， 能終止 mRNA的轉(zhuǎn)錄 標(biāo)記基因： 鑒別 受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的受體細(xì)胞篩選出來 ① 載體 與 表達(dá)載體 的區(qū)別：表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了 目的基因 、啟動(dòng)子、終止子三部分結(jié)構(gòu) （ 在限制酶切割位點(diǎn)上插入 ） 。 ② 用到的 工具酶 ： 既用到 限制酶 切割載體、目的基因，又用到 DNA連接酶 將目的基因和載體拼接，兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵。 ③ 啟動(dòng)子、終止子 對(duì)于目的基因的表達(dá)必不可少。 ④ 目的基因不能單獨(dú)進(jìn)入受體細(xì)胞， 必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去。 基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程： 載體 目的基因、 啟動(dòng)子、終止子 等元件 限制酶切割 DNA連接酶連接 基因表達(dá)載體 科學(xué)家在培育抗蟲棉
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