【正文】 （ 2）有個(gè)別不互補(bǔ)堿基時(shí)，雜交效率下降。 （ 3）非互補(bǔ)堿基越多，雜交效率越差。 （ 4）用一段寡聚核苷酸（ 8mer）的 所有可能的堿基排列序列 作探針。 8mer探針有 48= 65536 種序列。 如： 8mer靶 DNA 同 65536中的 一種 探針完全雜交形成 完全互補(bǔ) 雙鏈。 （ 5）根據(jù) 雜交效率 可推斷出靶 DNA的序列。 5’AGCCTAGC3’ Target 3’TCGGATCG5’ Probe 假如探針序列已知，則可推知靶 DNA序列。 但： 12mer靶 DNA 與 8mer探針雜交，將會(huì)有 5種 探針與之形成完全互補(bǔ)雙鏈。 3’TCGGATCG5’ 3’CGGATCGA5’ 3’GGATCGAC5’ 3’GATCGACT5’ 3’ATCGACTT5’ 5’AGCCTAGCTGAA3’ 12mer target 8mer probe 假如知道能與之完全雜交的所有 5種探針序列，就可推知 12bp的靶 DNA序列。 （ 1） DNA芯片（ chip） 把寡聚核苷酸探針的 3‘端或 5’端與玻璃或凝膠形成共價(jià)連接。不同堿基組合的寡核苷酸小區(qū)排列在一起形成探針點(diǎn)陣 . 目前可以做出 65536 種 8mer探針芯片。 2. 技術(shù)要點(diǎn) 每種探針的序列和位置已知，可被電腦讀出。 (2) （ 1）非放射性標(biāo)記 1981年第一臺(tái)商業(yè)化生產(chǎn)的 DNA自動(dòng)測(cè)序儀誕生。 四、 DNA自動(dòng)化測(cè)序 熒光物質(zhì)標(biāo)記。用激光能激發(fā)出 不同顏色的熒光。 1. 技術(shù)要點(diǎn) （ 2）不同的標(biāo)記對(duì)象 既可標(biāo)記 引物 ，也可標(biāo)記 ddNTP。 （ 4）分析自動(dòng)化 （ 3）讀片的自動(dòng)化 激光探頭直接讀膠，實(shí)時(shí)閱讀。 （ 2）反應(yīng)的自動(dòng)化 Sanger脫氧終止法。 電腦自動(dòng)把熒光信號(hào)轉(zhuǎn)化成對(duì)應(yīng)的堿基，并打印出 DNA序列。 （ 5）反應(yīng)可在一個(gè)試管中進(jìn)行 標(biāo)記 ddNTP時(shí)。 2. 熒光標(biāo)記引物的自動(dòng)化測(cè)序 ① 分別用 4種熒光物標(biāo)記 引物 ， ② 區(qū)分反應(yīng)產(chǎn)物， ③混合 電泳， ④激光一次 讀膠， ⑤電腦 合成結(jié)果。 3. 熒光標(biāo)記 ddNTP自動(dòng)測(cè)序原理圖解 4種不同的熒光物分別標(biāo)記 4種 ddNTP 可在同一管中進(jìn)行 可在單一泳道電泳。 測(cè)序結(jié)果 第六節(jié) 基因定點(diǎn)突變技術(shù) 基因突變：基因組 DNA分子在結(jié)構(gòu)上發(fā)生堿基 對(duì)中組成或排列順序的改變 ,并引起 個(gè)體表型的改變 ,而使生物體發(fā)生遺 傳變異 .分為 自發(fā)突變 和 誘發(fā)突變 . A 寡核苷酸介導(dǎo)的基因突變 : 1 寡核苷酸引物誘變技術(shù) 2 盒式誘導(dǎo)突變 1 寡核苷酸引物誘變技術(shù) 使用化學(xué)合成的含有突變堿基的寡核苷酸短片斷作為引物 ,啟動(dòng)單鏈 M13噬菌體 DNA進(jìn)行復(fù)制 ,隨后這段寡核苷酸引物成為新合成 DNA子鏈的一個(gè)組成部分 ,新生的子鏈便具有發(fā)生突變的堿基序列 . 原理 : 技術(shù)條件 : 載體 引物 2 盒式誘導(dǎo)突變 以各種雙鏈質(zhì)粒 DNA為載體 ,采用人工合成的具有突變序列的寡核苷酸片斷置換待改造基因中兩個(gè)限制酶切點(diǎn)之間的序列 ,在轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中形成數(shù)量眾多的突變體 .這些突變體就好象不同的盒式錄音磁帶 ,可隨時(shí)插入制備好的質(zhì)粒中 . B PCR定點(diǎn)突變技術(shù) 應(yīng)用 PCR技術(shù)在 DNA模板中預(yù)先確定的位置上引入單個(gè)或多個(gè)堿基的改變 . 1 引物 PCR定點(diǎn)誘變法 2 重組 PCR定點(diǎn)誘變法 第七節(jié) 酵母雙雜交系統(tǒng) Yeast Two Hybrid System (Interaction trap) 90年代，紐約大學(xué)的 S. Field等建立。 有效地分離能與一種已知的靶蛋白相互作用的蛋白編碼基因 二、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理 許多真核生物的 轉(zhuǎn)錄激活因子 都是由兩個(gè)在結(jié)構(gòu)上可以分開(kāi)的、功能上也相互獨(dú)立的 結(jié)構(gòu)域組成。 1. 結(jié)構(gòu)域（ Domain）合作 一、酵母雙雜交系統(tǒng)的作用 例如： 啤酒酵母的半乳糖苷酶基因激活因子 GAL4: DNA binding domain Active domain N C 1147aa 768881aa 上游激活序列（ UAS） 轉(zhuǎn)錄機(jī) GAL4效應(yīng)基因 結(jié)合 結(jié)合 激活轉(zhuǎn)錄 只要 DNA binding domain（ DNABD）與 Active domain（ AD）靠近就能夠表現(xiàn)轉(zhuǎn)錄激活活性。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)： 轉(zhuǎn)錄表達(dá) 2. 拆開(kāi) Domain DNA binding domain Active domain 上游激活序列（ UAS） 轉(zhuǎn)錄機(jī) GAL4效應(yīng)基因 結(jié)合 用重組 DNA技術(shù)把 GAL4的兩個(gè) Domain分開(kāi)，就 喪失 了激活效應(yīng)基因的能力。 不能轉(zhuǎn)錄 3. 重組 Domain 用重組 DNA技術(shù)把這兩個(gè) Domain分別與兩個(gè)不同的多肽連接。 Active domain 蛋白 A 蛋白 B DNA binding domain 在體內(nèi)，蛋白 A與蛋白 B是否能結(jié)合。 通過(guò)效應(yīng)基因是否被激活來(lái)檢查： 4. 觀察報(bào)告基因表達(dá) 上游激活序列（ UAS） 轉(zhuǎn)錄機(jī) GAL4效應(yīng)基因 蛋白 A DNA binding domain 轉(zhuǎn)錄激活 domain 蛋白 B GAL4的 DB domain與 AD Domain也不能靠近 ，所以仍然不能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。 不能轉(zhuǎn)錄 （ 1）如果蛋白 A與蛋白 B不能相互結(jié)合 上游激活序列（ UAS） 轉(zhuǎn)錄機(jī) GAL4效應(yīng)基因 蛋白A DNA binding domain 轉(zhuǎn)錄激活 domain 蛋白B 激活轉(zhuǎn)錄 GAL4的 DB domain與 AD Domain也能靠近 ，所以能啟動(dòng)效應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。 轉(zhuǎn)錄表達(dá) （ 2）如果蛋白 A與蛋白 B能相互結(jié)合 雙雜交原理 X基因和 Y基因產(chǎn)物的相互結(jié)合，導(dǎo)致 reporter gene表達(dá)。 Reporter gene表達(dá)就可說(shuō)明 X基因產(chǎn)物于 Y基因產(chǎn)物能結(jié)合。 三、構(gòu)建雙雜交體系的宿主菌 刪除基因組中的內(nèi)源野生型 GAL4基因 使酵母菌只能利用 載體 表達(dá)的 GAL4蛋白。 如： SFY526。 HF7c等菌株。 四、構(gòu)建報(bào)告基因（ reporter gene） GAL4激活組氨酸合成酶的表達(dá)，使酵母菌能生長(zhǎng)在 組氨酸缺乏培養(yǎng)基 上。 GAL4的效應(yīng)基因是 his3/lacZ/URA3。 此外還有其他營(yíng)養(yǎng)缺陷。 1. 穿梭質(zhì)粒（ shuttle plasmid） 五、構(gòu)建雙雜交體系的穿梭質(zhì)粒 既能在大腸桿菌中復(fù)制，又能在酵母菌中復(fù)制和表達(dá)的質(zhì)粒。 2. 雙雜交體系需要兩種穿梭質(zhì)粒 分別攜帶 已知的靶蛋白基因 和攜帶 未知基因 序列。 靶基因按正確的讀碼結(jié)構(gòu)和取向克隆在 GAL4的BD之后。 （ 1） BDplasmid P: ADH1啟動(dòng)子。 T: ADH1終止子。 篩選標(biāo)志： TRP 核定位信號(hào)是 GAL4本身的一部分 ADH： Alcohol dehydrogenase （ 2） ADplasmid 外源基因按正確閱讀框克隆到 GAL4的 AD片斷之后。 P: ADHI啟動(dòng)子。 T: ADHI終止子。 篩選標(biāo)志： LEU2 核定位信號(hào)是SV40的 T抗原的序列 六、酵母雙雜交的實(shí)驗(yàn)過(guò)程 1. 把蛋白 A插入到 BD質(zhì)粒上（ pGBT9） 2. 把蛋白 B插入到 AD質(zhì)粒上（ pGAD424） 3. 兩種重組質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母菌（ HF7c） 報(bào)告基因： HIS（合成組氨酸） 4. 篩選觀察 （ 1）存活選擇 在缺少 亮氨酸（ LEU）和色氨酸（ TRP） 培養(yǎng)基上篩選 雙載體 轉(zhuǎn)化子。 雙載體轉(zhuǎn)化才能合成亮氨酸和色氨酸，菌體存活。 Trp Leu 在缺少 組氨酸（ HIS）、亮氨酸（ LEU）和色氨酸（ TRP） 的培養(yǎng)基上篩選蛋白 A和蛋白 B能相互作用的雙載體轉(zhuǎn)化子。 （ 2）蛋白結(jié)合選擇 His Trp Leu