基因工程原理與技術(shù)(編輯修改稿)
2024-10-08 20:52 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 野生型 λ噬菌體不能在在 P2噬菌體的溶源菌中生長，即為Spi+表型 。當(dāng)其缺失 red、 gam基因，就能在 P2溶源菌中能生長并形成噬菌斑，便獲得 Spi表型 。 這類載體的中間填充片段上都具有 red、 gam基因，當(dāng)中間填充片段被外源 DNA取代后，重組體便能在 P2溶源菌中生長并形成噬菌斑，而非重組體則不能在 P2溶源菌中生長，這種篩選重組體的方法稱為 Spi選擇 。 λZAP插入型載體 在 λZAP中，含有一個 pBluescript噬菌粒的 DNA片段 (見下圖 )，位于 J基因和 cI基因之間，兩側(cè)是 f1復(fù)制起始子和終止子 ，在輔助噬菌體 M13或 f1存在下，能獲得帶外源 DNA的噬菌粒，用于測序和限制圖譜構(gòu)建等 (其它 λ載體的缺陷 )。 第三節(jié) 單鏈 DNA噬菌體載體 M1 f fd是一類絲狀大腸桿菌噬菌體，都含有同源性很高的 DNA分子。目前，以 M13噬菌體構(gòu)建出一系列單鏈 DNA 噬菌體載體。 優(yōu)點 ：①它們不存在包裝限制問題，能包裝 6倍基因組長的 DNA分子，克隆容量大。②制備單鏈 DNA分子，用于基因定點突變、基因測序、雜交探針制備等。③容易地測定出外源 DNA片段的插入方向。④可從大腸桿菌中制備雙鏈的復(fù)制型 DNA，如同質(zhì)粒一樣，能在體外進(jìn)行基因克隆操作。⑤其兩種形式的 DNA分子都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌，或產(chǎn)生噬菌斑，或形成侵染的菌落。 一、 M13噬菌體的一般生物學(xué)特性 M13噬菌體的基因組結(jié)構(gòu) 基因 VIII和基因 III、基因 II和基因 IV之間的間隔區(qū)較長，其他基因間隔區(qū)只有數(shù)個核苷酸。 雖然基因 II和基因IV之間的間隔區(qū) (507nt)包含有復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列，但 外源 DNA在此插入，并不影響噬菌體DNA的復(fù)制。 M13噬菌體感染、復(fù)制及包裝 M13噬菌體的繁殖并不會導(dǎo)致宿主細(xì)胞發(fā)生溶菌，但會減慢其生長。 基因 II 基因 Ⅴ 二、 M13噬菌體載體的構(gòu)建 M13mp1是構(gòu)建的第一個 M13噬菌體載體，是在 M13噬菌體的 IG區(qū)段的 BsuI限制酶切位點上插入了大腸桿菌的 lacZ’序列，但僅具有基因工程中不常用的 AvaII、 BglII、 PvuI的單一酶切位點及 PvuII三個酶切位點。 M13mp2 是利用點突變把 M13mp1的 ?肽的第 5個氨基酸密碼子中的鳥嘌呤轉(zhuǎn)換成腺嘌呤，從而引入了一個 EcoRI限制酶切位點。 M13mp3 同樣是在 M13mp1的 ?肽的第 119密碼子位置引入一個 EcoRI限制酶切位點。 M13mp7~1 M13mp18和 M13mp19等是在 M13mp2的EcoRI位點引入人工合成的多克隆位點。 M13mp7的 MCS呈對稱排列 ,而其他的呈非對稱排列 ,這樣用兩種酶消化會產(chǎn)生兩種末端的 DNA片段 . 三、 M13噬菌體載體的主要用途 ① DNA 測序； ② 基因定點突變； ③ 探針制備。 四、 M13噬菌體載體的缺點 ①插入的外源 DNA片段不穩(wěn)定，片段越大，越容易發(fā)生缺失或重排。一般情況下其有效的最大克隆能力僅 。 ②理論上 M13噬菌體載體克隆外源 DNA片段有兩種插入方向，但實際上外源 DNA總是按一種主要的取向插入的。 五、噬菌粒載體 噬菌粒載體 是一類含有單鏈?zhǔn)删w (M13)復(fù)制起點的質(zhì)粒載體。 噬菌粒載體的優(yōu)點 ： ①分子量較小，約為 3kb，可克隆 10kb的外源 DNA片段。 ②在宿主細(xì)胞內(nèi)可按質(zhì)粒 DNA復(fù)制，形成的雙鏈 DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn)。當(dāng)輔助噬菌體存在時，按 M13噬菌體的滾環(huán)復(fù)制模型進(jìn)行復(fù)制產(chǎn)生單鏈 DNA分子。 ③具有多種功能。如基因 克隆、基因定點突變、 DNA測序、體外轉(zhuǎn)錄等 在多克隆位點的兩側(cè)具有 T7噬菌體啟動子 ，可進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。 第四節(jié) 黏粒載體 (cosmid vector ) 黏粒載體 是一類含有 λ噬菌體 cos序列 的質(zhì)粒載體。又稱柯斯質(zhì)粒載體。 一、黏粒載體的特點 ①具有 λ噬菌體的體外包裝、 高效感染 等特性。當(dāng)然黏粒載體本身不能在體外被包裝，只有在克隆了合適長度的外源 DNA片段，才能被包裝成噬菌體顆粒，這是對重組子的正選擇。 ②具有質(zhì)粒載體的易于克隆操作、選擇及高拷貝等特性。 ③黏粒載體的分子量較小， 克隆容量大 。按 λ噬菌體包裝限制 (38~51kb)，黏粒載體的 最大克隆容量為 48kb(如pHS262)， 最低為 14kb(如 pJC720)。 ④具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組的能力。 二、黏粒載體的構(gòu)建 黏粒載體都是在通用的克隆質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，引入cos序列以及其它一些序列構(gòu)建而成的。如 pHC79來源于pBR322， pJB8來源于 pAT153。 此外，①引入兩個 cos位點，如 c2XB，解決黏?？寺〈嬖诘膯栴}；②在多克隆位點兩側(cè)引入一對 T T7噬菌體啟動子，制備 RNA 探針，用于鑒別黏粒文庫中的重疊克隆。如 pWE1 pWE16。 ③構(gòu)建與常用的大腸桿菌質(zhì)粒載體沒有同源性序列的黏粒載體。如 pcos1EMBL，與 colE1之間缺乏同源性。④導(dǎo)入真核細(xì)胞病毒的復(fù)制起點及相關(guān)選擇性標(biāo)記，從而構(gòu)建了大腸桿菌 真核細(xì)胞的穿梭載體。如pWE1 pWE16等。 三、黏粒克隆的基本程序、存在的問題及解決方案 黏?？寺∈侵笐?yīng)用黏粒載體克隆大片段 DNA的技術(shù)。 黏?？寺〉幕境绦? 黏?？寺〈嬖诘膯栴}及解決方案 ①在連接反應(yīng)中，黏粒載體片段彼此首尾相連形成多聚體分子。 解決方案 ： 一是 用堿性磷酸酶處理，可阻止載體分子自身連接； 二是 使用 IshHorowiczBurke黏?？寺》桨?(見下圖 )； 三是 使用 BatesSwift黏粒克隆方案 (雙 cos序列的黏粒載體 ， 見下圖 )。 ②在連接反應(yīng)中，酶切的基因組 DNA片段 (特別是較小的 DNA 片段 )往往會出現(xiàn)兩個或數(shù)個片段隨機再連接，串聯(lián)地插入到載體上，其連接順序并不符合基因組中排列順序。因此， DNA序列分析結(jié)果往往會出現(xiàn)錯誤。 解決方案 是將局部消化產(chǎn)物通過凝膠電泳分級分離，獲得長度為 31~45kbDNA片段。 IshHorowiczBurke黏?？寺》桨? Partial Sau3A digestion Phosphatase Partial Sau3A digestion, phosphatase BamHI SmaI BatesSw
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