【正文】 ② β葡萄糖苷酸酶基因 (GUS) β葡萄糖苷酸酶催化 5溴 4氯 3吲哚 β葡糖苷酸酯 (XGluc)形成蘭色產(chǎn)物，使表達(dá)的細(xì)胞或組織染成藍(lán)色。 ③誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 光誘導(dǎo)啟動(dòng)子 (核酮糖二磷酸羧化酶小亞基基因 )、 熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子 (果蠅 hsp70S基因 )、 創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子 (蛋白酶抑制劑基因 )等。如 pET載體 (見下圖 )。 ④真核生物 poly(A) 位點(diǎn)。腺病毒載體的最大克隆容量約 10kb。因此，痘苗病毒載體常用來構(gòu)建 痘苗病毒活疫苗 。 反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建原理 ：順式作用序列是反轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行整合、復(fù)制所必需的，而反式作用序列不必自身具備，可由輔助病毒提供。 煙草花葉病毒 (TMV，見下圖 ) 、馬鈴薯 X病毒 (PVX，見下圖 ) 已通過外源基因插入到運(yùn)動(dòng)蛋白基因與外殼蛋白基因之間或取代外殼蛋白基因在植物中表達(dá)。 克隆容量 ： 300kb 優(yōu)點(diǎn) ： 拷貝數(shù)低，穩(wěn)定，比YAC易分離 。 IshHorowiczBurke黏?？寺》桨? Partial Sau3A digestion Phosphatase Partial Sau3A digestion, phosphatase BamHI SmaI BatesSwift黏粒克隆方案 四、常用黏粒載體及應(yīng)用 常用的黏粒載體 ： pJB c2XB、 pHC7 pWE1pWE1 pcos1EMBL、 Charomid系列等。④導(dǎo)入真核細(xì)胞病毒的復(fù)制起點(diǎn)及相關(guān)選擇性標(biāo)記，從而構(gòu)建了大腸桿菌 真核細(xì)胞的穿梭載體。按 λ噬菌體包裝限制 (38~51kb)，黏粒載體的 最大克隆容量為 48kb(如pHS262)， 最低為 14kb(如 pJC720)。 ③具有多種功能。 M13mp7的 MCS呈對(duì)稱排列 ,而其他的呈非對(duì)稱排列 ,這樣用兩種酶消化會(huì)產(chǎn)生兩種末端的 DNA片段 . 三、 M13噬菌體載體的主要用途 ① DNA 測(cè)序； ② 基因定點(diǎn)突變； ③ 探針制備。⑤其兩種形式的 DNA分子都能夠轉(zhuǎn)染感受態(tài)的大腸桿菌，或產(chǎn)生噬菌斑，或形成侵染的菌落。 這類載體的中間填充片段上都具有 red、 gam基因，當(dāng)中間填充片段被外源 DNA取代后，重組體便能在 P2溶源菌中生長(zhǎng)并形成噬菌斑，而非重組體則不能在 P2溶源菌中生長(zhǎng)，這種篩選重組體的方法稱為 Spi選擇 。 ④引入無義突變 在裂解周期的必需基因內(nèi)引入無義突變， λ噬菌體便只能在具有無義突變抑制基因的大腸桿菌宿主中存活。 插入型載體 ：只具有 一個(gè)克隆位點(diǎn) 可供外源 DNA插入的 λ噬菌體載體。 如： 大腸桿菌 土壤農(nóng)桿菌 穿梭質(zhì)粒載體 (植物轉(zhuǎn)化載體 )、 大腸桿菌 釀酒酵母 穿梭質(zhì)粒載體 (見下圖 )、 大腸桿菌 枯草芽孢桿菌 穿梭質(zhì)粒載體 (pHV1 pEB10)、 大腸桿菌 動(dòng)物細(xì)胞 穿梭質(zhì)粒載體 (pBPVBV1)，但還沒有大腸桿菌 植物細(xì)胞穿梭質(zhì)粒載體。 E c o S ac Kp n S m a B am X b a S al P s t S p h Hi nRI I I I HI I I I I d I I IpU C 1 8pU C 1 9Hi n S p h P s t S al Xba B am S m a K p n S ac E c od I I I I I I I HI I I I RIApO r iL a c Z( 8kb )rpUC質(zhì)粒載體較 pBR322有四個(gè)優(yōu)點(diǎn) T載體 HphI 的識(shí)別序列 T/A克隆 表達(dá)質(zhì)粒載體 表達(dá)質(zhì)粒載體 是指專用于在宿主細(xì)胞中高水平表達(dá)外源蛋白質(zhì)的質(zhì)粒載體。 優(yōu)點(diǎn)： a、失去了 pBR322的HaeII的兩個(gè)片段，分子量更小，拷貝數(shù)高 pBR322的~3倍； b、失去了 nic位點(diǎn)，更安全。 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移性 是指質(zhì)粒從一個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到另一個(gè)細(xì)胞的特性。存在于 細(xì)菌 (最廣泛 )、放線菌、真菌以及一些動(dòng)植物細(xì)胞中。第三章 基因工程載體 載體 (vector)是指基因工程中攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞的“運(yùn)載工具”，其本質(zhì)是 DNA復(fù)制子。 質(zhì)粒的分子特性 雙鏈環(huán)形 DNA(絕大多數(shù) )、雙鏈線形DNA、 RNA(酵母的殺傷質(zhì)粒 )。 質(zhì)粒 接合型質(zhì)粒 (自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 ):多屬于嚴(yán)緊型 非接合型質(zhì)粒 (不能自我轉(zhuǎn)移質(zhì)粒 ):多屬于松弛型 質(zhì)粒的遷移作用 是指非接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒共存時(shí)可發(fā)生轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。 pAT153 ② 引入帶單一 EcoRI的選擇標(biāo)記；如 pBR324(，具有大腸桿菌素 E1基因和免疫 imm基因 )、 pBR325(氯霉素抗性基因 )。 表達(dá)載體 (根據(jù)受體細(xì)胞 ) 原核細(xì)胞表達(dá)載體 真核細(xì)胞表達(dá)載體 表達(dá)載體 (根據(jù)表達(dá)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn) ) 分泌型表達(dá)載體 非分泌型表達(dá)載體 表達(dá)載體 (根據(jù)表達(dá)蛋白的組成 ) 融合型表達(dá)載體 非融合型表達(dá)載體 pBV221 rrnB 大腸桿菌表達(dá)載體的特征 (與克隆載體相比 )： ①?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子；如 Lac、 Trp、 Tac、 PL、 PR、 T7啟動(dòng)子 。 第二節(jié) λ噬菌體載體 一、 λ噬菌體載體的生物學(xué)特性 λ噬菌體的生活周期 λ噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)和功能 cos位點(diǎn) (cohesiveend site)： λDNA環(huán)化時(shí)其粘性末端形成的雙鏈區(qū)段 . 左側(cè)區(qū)： A~J，約 20kb 右側(cè)區(qū)： N~R，約 12kb 中間區(qū)： J~N，約 18kb， 為非必須區(qū)段 cI 基因控制溶源過程，阻遏溶菌周期所有基因的表達(dá) λ噬菌體的 DNA復(fù)制 裂解周期的早期 ： θ型雙向復(fù)制 ，產(chǎn)生 環(huán)狀 DNA分子 ； 裂解周期的晚期 ： σ型滾環(huán)復(fù)制 ，產(chǎn)生 線性多聚體 DNA分子 。 克隆容量較小 ，一般在 10kb以內(nèi)，用于cDNA及小片段 DNA的克隆 。如Charon 4A是在晚期基因 A、 B中引入了琥珀突變 。 λZAP插入型載體 在 λZAP中，含有一個(gè) pBluescript噬菌粒的 DNA片段 (見下圖 )，位于 J基因和 cI基因之間，兩側(cè)是 f1復(fù)制起始子和終止子 ，在輔助噬菌體 M13或 f1存在下，能獲得帶外源 DNA的噬菌粒，用于測(cè)序和限制圖譜構(gòu)建等 (其它 λ載體的缺陷 )。 一、 M13噬菌體的一般生物學(xué)特性 M1