基因工程下游技術(shù)ppt課件(編輯修改稿)
2024-10-08 18:26 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 蛋白質(zhì)按照分子量的大小分開 原理 以分子大小和形狀為分離基礎(chǔ)的 。具體說就是利用不同大小分子通過凝膠滯留時(shí)間的差別來分離混合物的柱層析方法。另外一種說法是分離是以分子體積的大小為基礎(chǔ)的 ,分子體積即分子溶劑化后的體積 ,受分子形狀和相對(duì)分子質(zhì)量?jī)煞矫嬉蛩氐挠绊?。有時(shí)加入變性劑 (尿素、鹽酸胍等 )以破壞蛋白質(zhì)的三、四級(jí)結(jié)構(gòu) ,使分離主要受控于相對(duì)分子質(zhì)量的大小。 20221030 17 基因工程下游技術(shù) 介質(zhì)： (1) Sephadex: (交聯(lián)葡聚糖 ) G25, G50, G75, G100 Biogel: (聚丙烯酰胺 ) P6， P30， P60， P100 Sepharose: (瓊脂糖 ) 2B, 4B, 6B (2) Sephacryl（ 葡聚糖 聚丙烯酰胺 ) : S100, S200, S300 (3) Sepharose、 Superose: HPLC (4) superdex (瓊脂糖 葡聚糖 ) : HPLC 20221030 18 基因工程下游技術(shù) 20221030 19 基因工程下游技術(shù) 原理： 根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的差異將不同蛋白質(zhì)分開 。 離子交換介質(zhì)： (1)離子交換樹脂 (2)纖維素類： DEAE、 CM (3)葡聚糖類 Sephadex： Sephadex C2 Sephadex C50 (4)瓊脂糖類 Sepharose ：分辨率較高 (5)Mono Beads類 : HPLC 陽離子：強(qiáng)酸型 S、 SM、 SE、 SP。弱酸型 C、 CM 陰離子：強(qiáng)堿型 TEAE、 QAE、 SE、 SP。中等堿型： DEAE 螯合型： BA、 CAI、 A、 SAHP 20221030 20 基因工程下游技術(shù) ? 離子交換層析 是以蛋白質(zhì)分子凈電荷和表面電荷分布為分離基礎(chǔ)的。具體說就是利用蛋白質(zhì)帶電性的差異 ,在離子吸附劑上靜電吸附能力不同 ,用不同的 pH/離子強(qiáng)度洗脫液洗脫 ,從而使蛋白質(zhì)分離的柱層析方法。 ? 離子交換 又分為 陰離子交換 和 陽離子交換 。 ? 洗脫方式： 陽離子交換主要是改變 pH,它主要應(yīng)用于等電點(diǎn)大于 5的蛋白質(zhì) 。而陰離子交換主要是改變鹽濃度 ,適用于大部分蛋白質(zhì)。 ? 離子交換層析 處理量大 ,附載系數(shù)高 ,一步縮小樣品體積很多。其去除雜質(zhì)能力強(qiáng) ,如對(duì)熱原質(zhì)、核酸、外毒素、小牛血清中大部分蛋白及電荷性有差別的蛋白均可去除。 ? 離子交換層析 的洗脫一般分 3種 :同步洗脫、分步洗脫 、梯度洗脫。 20221030 21 基因工程下游技術(shù) 20221030 22 基因工程下游技術(shù) 原理： 利用蛋白質(zhì)特異性進(jìn)行分離。 介質(zhì)準(zhǔn)備： 載體選擇 ： Sepharose 4B、 Sepharose CL 4B、 Sepharose Fast Flow、 Sepharose High Performance 空間臂 ： 偶聯(lián)小分子時(shí)需要空間臂，常為雙功能基團(tuán)，如己二氨或ε －氨基己酸。 配基選擇 ： 抗原 ― 抗體、酶 ― 抑制劑、酶 ― 底物、激素 ― 受體、金屬結(jié)合蛋白 ― 螯和劑、含巰基蛋白 ―Hg 或含巰基分子凝集素 ― 糖蛋白 偶聯(lián) ： I 溴化氰法：與 α －氨基或 ε －氨基偶聯(lián)。 效率高，反應(yīng)時(shí)間短，條件溫和，適于多種蛋白。 II環(huán)氧氯丙烷法：與－ NH2 、 ―OH 、 ―SH 偶聯(lián) 偶聯(lián)時(shí)需強(qiáng)烈條件，如 pH11， 50℃ ，適于特別穩(wěn)定的蛋白 20221030 23 基因工程下游技術(shù) ? 親和層析 是以蛋白質(zhì)特殊結(jié)構(gòu)為分離基礎(chǔ)的。具體說就是利用蛋白質(zhì)和介質(zhì)特殊的生物親和性或?qū)Ｒ恍院推渌鞍踪|(zhì)分離的柱層析方法。如酶 底物或抑制物 ,抗原 抗體。 ? 親和層析 的三個(gè)基本條件是 : 偶聯(lián)凝膠 :起支架作用； 配體 :在支持物和分離物間起聯(lián)接作用 ,和分離物特異的親和吸附具有專一性 ,并且是可逆的。 間臂 :由于生物大分子空間位阻作用 ,需加一間臂 ,長(zhǎng)度很重要 ,太短不起作用 ,太長(zhǎng)增加非特異性吸附 ,降低親和作用效率 , ? 親和層析 具有
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