理學(xué)基因工程ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-10 22:56 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 得大量細(xì)胞繁殖群體 ? 重組體的篩選 目的基因的提取與擴(kuò)增 目的基因的提取 ? 目的基因的提取主要依靠使用工具酶來完成的，其主要分為三大類： 限制性內(nèi)切酶，連接酶，修飾酶 ? 限制性內(nèi)切酶 ? 對(duì) DNA具有堿基專一性的內(nèi)切酶：降解外源的，未經(jīng)特殊修飾的 DNA。不降解自身細(xì)胞的 DNA（位點(diǎn)上甲基化修飾） 分類： ? I類和 III類：隨機(jī)切割，很難形成穩(wěn)定特異性切割末端?；静挥? ? II類限制性內(nèi)切酶：識(shí)別特定的核苷酸序列，識(shí)別的DNA長度一般為 4， 5， 6；具有特定酶切位點(diǎn) 限制性內(nèi)切酶切割 DNA的位點(diǎn) ? DNA在限制性內(nèi)切酶的作用下，使多核苷酸鏈上磷酸二酯鍵斷開的位置被稱為切割位點(diǎn) ? 限制性內(nèi)切酶只作用于具有特殊的序列的 DNA位點(diǎn)，如，回文結(jié)構(gòu)， 圖 ? 有些限制性內(nèi)切酶雖然識(shí)別序列不同，但是切割 DNA分子后所得到的 DNA片斷具有相同的黏性末端，稱這樣的一組限制性內(nèi)切酶為同尾 酶，如 T|CGA、 AT|CGAT、 GT|CGAC均產(chǎn)生5’CG末端 ? DNA連接酶 ? DNA連接酶能催化雙鏈 DNA片斷緊靠在一起的3’OH末端與 5’P末端之間形成磷酸二酯鍵，常用的 DNA連接酶有： DNA連接酶：此連接酶只能催化雙鏈DNA互補(bǔ)黏性末端之間的連接，不能催化平末端的之間的連接 T4 DNA連接酶：既可以催化雙鏈 DNA互補(bǔ)黏性末端之間的連接，又可以催化平末端的之間的連接 ? 修飾酶 ? 待連接的兩個(gè) DNA片斷經(jīng)過切割后未必能產(chǎn)生互補(bǔ)黏性末端或平末端，此時(shí)需要將 DNA修飾以后再連接，修飾的方法有： 1. DNA片斷末端同聚物加尾后進(jìn)行連接 5’端脫磷酸化作用后連接 目的基因的擴(kuò)增 ? 目的基因獲得以后需要對(duì)其進(jìn)行大量的擴(kuò)增，目前最廣泛采用的基因擴(kuò)增技術(shù)是 PCR技術(shù)（ The Polymerase Chain Reaction)，其主要原理是利用了 DNA的 變性、復(fù)性與雜交 DNA變性（熔解） ? DNA在加熱或某些試劑作用下， DNA配對(duì)堿基之間的氫鍵結(jié)構(gòu)受到破壞，雙鏈 DNA的多核苷鍵完全分離 ? DNA變性后的特點(diǎn) 變性后的 DNA溶液：粘度降低；沉降速率增高；紫外光吸收急劇增高；生物功能減小或消失。 ? 當(dāng)吸光度值達(dá)到最大值一半時(shí)的溫度作為熔點(diǎn)溫度（ Tm） ， Tm的數(shù)值主要受到以下因素影響
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