基因工程原理復(fù)習(xí)重點(編輯修改稿)
2024-11-30 16:44 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 ’ 側(cè)翼序列區(qū)，但也有的是位于轉(zhuǎn)錄區(qū)和 3’ 側(cè)翼序列區(qū)。 增強子的功能作用： ① 成環(huán)作用； 增強子可影響模板附近的 DNA 超螺旋的密度（結(jié)構(gòu)），諸如導(dǎo)致 DNA 超螺旋彎曲，或是在反式作用因子參與下，以蛋白質(zhì)之間的相互作用為媒介，使增強子和啟動子之間的 DNA“成環(huán)”的連接模式起始轉(zhuǎn)錄。 ② 固定作用 將模板固定在細(xì)胞內(nèi)特定位置，如連接在核基質(zhì)上，有利于拓?fù)洚悩?gòu)酶改變 DNA 雙螺旋結(jié)構(gòu)張力，有利 于促進(jìn) RNA 聚合酶在 DNA 鏈上的結(jié)合與滑動。 ③ 引導(dǎo)作用 可以為反式因子或 RNA 聚合酶 II 提供進(jìn)入染色體結(jié)構(gòu)的“進(jìn)入位點”。 20. 基因的分類 (1)按拷貝數(shù)分： 單拷貝基因， 多拷貝基因 (2)按產(chǎn)物類型分： 結(jié)構(gòu)基因，調(diào)節(jié)基因 (3)按表達(dá)特性分：組成基因， 誘導(dǎo) 基因 (4)按實驗用途分：選擇基因，報告基因 (5)按排列組合特點分： 基因家族，基因簇 選擇基因： 指可使被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞獲得其親本細(xì)胞所不具有的新的遺傳特征，從而使得人們能夠使用特定的 選擇培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)化的新細(xì)胞 (即轉(zhuǎn)化子 )，從其親本細(xì)胞群體中選擇出來的一類特殊的基因。 報告基因： 特指其編碼產(chǎn)物能被快速檢測，常用來判斷外源基因是否已經(jīng)成功地導(dǎo)入寄主細(xì)胞、器官或組織的一類特殊基因。 21. 基因工程誕生的理論基礎(chǔ) (1)20 世紀(jì) 40 年代確定了遺傳信息的攜帶者 (分子載體 )是 DNA 而不是蛋白質(zhì)。 (2)20 世紀(jì) 50 年代的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型與半保留復(fù)制機理 (3)20 世紀(jì) 50 末 60 初，科技工作者提出中心法則和操縱子學(xué)說，遺傳密碼的破譯，闡明了信息流的方向。 22. 基因工程誕生的技術(shù)基礎(chǔ) (1)核酸 內(nèi)切限制酶， DNA 的體外切割與連接， DAN 連接酶； (2)DNA 核苷酸測序技術(shù)； （ 3）基因克隆載體的發(fā)展與應(yīng)用； （ 4）大腸桿菌遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)的建立； （ 5）瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)應(yīng)用； （ 6）核酸雜交技術(shù)的應(yīng)用。 23. 酶的分類 : 氧化還原酶類，轉(zhuǎn)移酶類，水解酶類，異構(gòu)酶類，裂解酶類，連接酶類。 24. 共線性的概念 （ 1）位于同一條染色體 DNA 或 DNA 分子上不同基因的位置排列關(guān)系 ； （ 2）不同物種中 DNA 的排列關(guān)系； （ 3）位于 DNA 分子及其轉(zhuǎn)錄本 RNA 分子間的共線性； （ 4） mRNA 密 碼的順序與蛋白質(zhì)氨基酸順序。 25. 切口（ Nick）： 在雙鏈 DNA 的某一條鏈上兩個相鄰核苷酸之間失去一個磷酸二酯鍵所出現(xiàn)的單鏈斷裂。 裂口（ Gap） :指雙鏈 DNA 分子的某一條鏈上，失去一個或連續(xù)幾個核苷酸時所出現(xiàn)的 DNA單鏈斷裂。 DNA 連接酶無法封閉裂口 。 26. 核算內(nèi)切限制酶： 是一類能夠識別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列，并由此切割 DNA雙鏈結(jié)構(gòu)的核酸內(nèi)切酶。 27.Ⅱ 型核酸內(nèi)切限制酶的特點 （ 1）與 Ⅰ 型、 Ⅱ 型不同，不具備多亞基的結(jié)構(gòu)，可在沒有修飾的情況下切割； （ 2）識別雙鏈 DNA 分子的限 制位點； （ 3）切割位點發(fā)生兩條鏈切割，形成互補黏性末端； （ 4）酶切反應(yīng)不需要能量； （ 5）因兩個單鏈切割部位是交錯的，黏性末端互補。 （ 1） DNA 的分子特性 a 識別位點周圍核苷酸堿基成分可影響其底物 DNA 消化的速率，有時達(dá) 25 倍； b 特定 DNA 分子中所具有的目標(biāo)限制位點的密度 ； c 完全超螺旋 DNA 分子比線性 DNA 分子消化時需要更多的酶； d DNA 分子的甲基化程度，如果位點發(fā)生甲基化，會強烈干擾核酸內(nèi)切限制酶的活性。 （ 2）酶切消化反 應(yīng)的溫度，大多最適溫度為 37℃ 。 （ 3） DNA 制劑的純度對酶切活性的影響 ，制劑中的污染物：酚，氯仿，蛋白質(zhì)，酒精，甘油，高鹽， SDS, EDTA 等； 29. 星號活性： 在反應(yīng)條件發(fā)生變更的情況下，核酸內(nèi)切限制酶便失去了切割其固有識別序列的能力，而會在新的識別序列上發(fā)生 DNA 分子切割。這種發(fā)生了改變的限制酶活性，叫做星號（ *）活性，或限制酶星號活性。 產(chǎn)生星號活力的原因：（ 1）酶用量的單位數(shù)與 DNA 用量的比值過高，超過 10U/μ g；（ 2）甘油濃度不可超過 5%；（ 3）二價離子 Mg2+被 Mn2+、 Cu2+Zn2+Ca2+取代；（ 4） Mg2+濃度低于 25mmol/L （ 5） Buffer pH 不能高于 8；（ 6）有機溶劑的干擾。 30. DNA 分子體外連接條件 （ 1）一條 DNA 鏈 3’端存在游離的 3’OH （ 2）一條 DNA 鏈 5’端存在游離的 5’磷酸基團(tuán) （ 3）連接體系需要能量 ATP 31. 堿性磷酸酶的類型： a 細(xì)菌堿性磷酸酶（ BAP） b 小牛腸堿性磷酸酶（ CIP） 32. 平末端 DNA 片段連接的方法 （ 1） T4 DNA 連接酶連接法 （ 2）同聚物 加尾 法 （ 3）限制片段末端修飾法 （ 4）銜接物連接法 （ 5） DNA 接頭連接法 33. T 載體結(jié)構(gòu)上有哪些優(yōu)點？ （ 1） T 載體是一種線性雙鏈 DNA，不需切割，即可擴(kuò)增 PCR 產(chǎn)物； （ 2） 3’–T 單核苷酸延伸末端，可 直接 與 PCR 產(chǎn)物具有 3’ –A 單核苷酸延伸的分子進(jìn)行 堿基 互補； （ 3）線性載體已經(jīng)脫去 5’ –P， 自己 不會再環(huán)化； （ 4） T 載體中設(shè)計了 Lac Z 基因，可通過顯色反應(yīng) X–gal 顯色反應(yīng)分離重組體 ； （ 5）在 T 載體的 3’末端附近還設(shè)計了多個核苷酸酶切位點 ，便于進(jìn)行多種亞克隆 ； （ 6） T 載體含有 T7， SP6 兩種啟動子，便于測序。 34. 理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具備 的條件 （載體的結(jié)構(gòu)特點） ： （ 1）必須具備復(fù)制起點； （ 2）具有抗生素抗性基因； （ 3）具有若干核酸內(nèi)切限制酶的酶切位點； （ 4）具有較小的分子量，較高的拷貝數(shù)。 35. λ 噬菌體基因組結(jié)構(gòu) （ 1）左側(cè)區(qū)，自基因 A 到基因 J，包括參與噬菌體頭部蛋白質(zhì)和尾部蛋白質(zhì)合成所需要的全部基因； （ 2）中央?yún)^(qū)，介于基因 J 與基因 N 之間，非必要區(qū)，編碼的基因與保持噬菌斑形成能力無關(guān)，但 包含了一些與重組有關(guān)的基因，以及使噬菌體整合到大腸桿菌染色體中去 的 int 基因，和把原噬 菌體從寄主染色體上刪除下來的 xis 基因； （ 3）右側(cè) 區(qū)，位于 N 基因的右側(cè)，包括全部主要的調(diào)控基因，復(fù)制基因，溶菌基因。 36. λ噬菌體載體的主要類型 取代型，插入型 37. λ ZAP 的結(jié)構(gòu)特點 λ ZAP 是一種典型的插入型 λ 噬菌體載體，可將插入的 DNA 片段直接從 λ 載體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒載體。其結(jié)構(gòu)特點： （ 1）其兩側(cè)是由兩個單鏈 DNA 噬菌體 f1 的復(fù)制信號，即 f1 起始子和 f1 終止子包圍著； （ 2）含有一個可以在體內(nèi)發(fā)生刪除作用的 pBluescript 噬菌粒的 DNA 片段； （ 3）在 pBluescript 噬菌粒兩端有 T3 和 T7 噬菌體啟動子的多克隆位點區(qū)，可制備 RNA 探針。 38. λ ZAP 的優(yōu)點 （ 1）具有多種核酸內(nèi)切限制酶的
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