【文章內(nèi)容簡介】 NA或RNA必須有539。OH的存在51．Southem印跡的DNA探針( )雜交。 (a)只與完全相同的片段 (b)可與任何含有相同序列的DNA片段 (c)可與任何含有互補序列的DNA片段’． (d)可與用某些限制性內(nèi)切核酸酶切成的DNA片段 (e)以上都是52． 用下列方法進行重組體的篩選，只有( )說明外源基因進行了表達。 (a)Southem印跡雜交 (b)Northem印跡雜交 (c)Western印跡 (d)原位菌落雜交53．下列哪一個不是Southern印跡法的步驟?( ) (a)用限制酶消化DNA (a)DNA與載體的連接 (c)用凝膠電泳分離DNA片段 (d)DNA片段轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上 (e)用一個標記的探針與膜雜交54． 報告基因( ) (a)以其易于分析的編碼序列代替感興趣基因的編碼序列 (b)以其易于分析的啟動子區(qū)代替感興趣基因的啟動子區(qū) (c)能用于檢測啟動子的活性 (d)能用于確定啟動子何時何處有活性55． 在利用lacZ失活的顯色反應(yīng)篩選法中，IPTG的作用是( ) (a)誘導(dǎo)宿主的α肽的合成 (b)誘導(dǎo)宿主的ω肽的合成 (c)作為酶的作用底物 (d)作為顯色反應(yīng)的指示劑56. 切口移位是指在( )作用下，使( )帶上放射性標記。 (a)DNA聚合酶I，RNA (b)DNA聚合酶I，DNA (c)DNA聚合酶Ⅲ，RNA (d)DNA聚合酶Ⅲ，DNA57．用于核酸分子雜交的探針可以是放射性標記的( ) (a)DNA (b)RNA (c)抗體 (d)抗原58．Southern印跡是用DNA探針檢測DNA片段，而Northern印跡則是：( ) (a)用RNA探針檢測DNA片段 (b)用RNA探針檢測RNA片段 (c)用DNA探針檢測RNA片段 (d)用DNA探針檢測蛋白質(zhì)片段59．用免疫化學法篩選重組體的原理是( ) (a)根據(jù)外源基因的表達 (b)根據(jù)載體基因的表達 (c)根據(jù)mRNA同DNA的雜交 (d)根據(jù)DNA同DNA的雜交 60．隨機引物標記探針，下列各項中哪一項是不正確的?( ) (a)雙鏈DNA、單鏈DNA、RNA都是可以標記的 (b)不需要用Dnase I預(yù)處理 (c)反應(yīng)時可用Klenow酶 (d)反應(yīng)時可用DNA聚合酶1 61．在切口移位標記DNA探針時只能使用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)DNA聚合酶Ⅱ (d)DNA聚合酶Ⅲ 62．要對一雙鏈的DNA分子進行3185。末端標記，可用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶答案1．c；2．c； 3．b； 4．b 5．b，C，d，e； 6．c； 7．b； 8．d；9．d； 10．B； 11．d； 12．a(chǎn)； 13．d； 14．b 15．d； 16．c；17．a(chǎn)，b；18．a(chǎn)；19．c；20．d；21．c；22．C； 23．b； 24．C；25．d；26．a(chǎn)，C，d；27．b；28．c； 29．b；30．a(chǎn)；31．c； 32．a(chǎn),c,d,e， 33．a(chǎn)，b，c；34．b； 35．c；36．c； 37．d； 38．b；39．c；40．a(chǎn)；41．c； 42．a(chǎn)，b，c； 43．b； 44．b； 45．d； 46．a(chǎn)；47．a(chǎn)； 48．c； 49．c；50．b；51．c； 52．c； 53．b； 54．a(chǎn),c,d；55．a(chǎn)； 56．b；57．a(chǎn)，b； 58．c；59．a(chǎn)；60．d；61．b； 62．c；三、簡答題1．說明Sanger DNA測序法的原理。2．某學生在用EcoRI切割外源DNA片段時，出現(xiàn)了星號活性，請分析可能的原因?3．在序列539。CGAACATATGGAGT339。中含有一個6bp的Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，該位點的序列可能是什么?4．下面幾種序列中你認為哪一個(哪些)最有可能是Ⅱ類酶的識別序列： GAATCG，AAATTT， GATATC， ACGGCA? 為什么?5．當兩種限制性內(nèi)切核酸酶的作用條件不同時，若要進行雙酶切，應(yīng)采取什么措施? 為什么?6． 為什么反轉(zhuǎn)錄酶在聚合反應(yīng)中會出錯?7． 什么是測序酶(sequenaseTM)?8． 什么是S1核酸酶作圖(S1 nuclease mapping)? 9 YAC載體具有什么樣的功能性DNA序列?為什么在克隆大片段時，YAC具有優(yōu)越 性?10． 列舉質(zhì)粒載體必須具備的4個基本特性。 11． 什么叫穿梭載體？ 12． 如何將野生型的l噬菌體改造成為一個理想的載體?13． PCR的基本原理是什么?用PCR擴增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息?14． cDNA克隆與基因組克隆有何不同?15． 怎樣將一個平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點中去?16． 簡述以黏粒為載體構(gòu)建基因文庫的原理。17． 酵母人工染色體要在酵母細胞中穩(wěn)定存在，必須有哪些基本的結(jié)構(gòu)?18． 何謂YAC? 主要特性是什么? 19． Muller的PCR反應(yīng)同大腸桿菌體內(nèi)的DNA復(fù)制有哪些不同?你認為根本的差別在 哪里?20．欲將一真核生物的結(jié)構(gòu)基因克隆后轉(zhuǎn)移到原核生物(如E．coli)中進行表達，克隆時應(yīng) 注意哪些問題?21．假定你分離到一個E．coli的Thy 突變體，并推測有可能是ThyA基因突變。請設(shè)計 一個方案用PCR從染色體DNA擴增突變的ThyA基因，測定突變的序列。(注：E．coli 野生型的ThyA基因的序列是已知的)22． 你在做Southern印跡分析，并且剛完成了凝膠電泳這一步。根據(jù)方案，下面一步驟 是用NaOH溶液浸泡凝膠，使DNA變性為單鏈。為了節(jié)省時間，你略過了這一步， 直接將DNA從凝膠轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上。然后用標記探針雜交，最后發(fā)現(xiàn)放射自 顯影片是空白。錯在哪里?23．切口移位(nick translation)標記探針的主要步驟有哪些?24．用EcoRI和Hind Ⅲ分別切割同一來源的染色體DNA，并進行克隆，在前者的克隆 中篩選到A基因，但在后者的克隆中未篩選到A基因，請說明原因。25．什么是Western印跡?它與Southern印跡有什么不同?26．用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+ Tet+的質(zhì)粒載體，已知該酶識別的是4個堿基序列， 并產(chǎn)生有兩個堿基突出的單鏈末端，該酶在lac基因內(nèi)有切割位點，并在第二個氨基 酸密碼子內(nèi)，該位點可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。用該酶切割后，用 DNA聚合酶將單鏈末端補齊為雙鏈的平末端，然后重新連接成環(huán)，轉(zhuǎn)化Lac Tets受體菌，篩選Tetr轉(zhuǎn)化子，問：Lac的基因型是什么?并說明原因。27．在基因工程中，為了在細菌細胞中表達真核生物的基因產(chǎn)物，為什么通常要用cDNA 而不用基因組DNA?為什么要在cDNA前加上細菌的啟動子?答案 1． 答： Sanger DNA測序法是建立在兩個基本原理之上：(1)核酸是依賴于模板在聚合酶的 作用下由539。端向339。端聚合(DNA聚合酶參與了細菌修復(fù)DNA合成過程)；(2)可延 伸的引物必須能提供游離的339。羥基末端，雙脫氧核苷酸由于缺少游離的339。羥基末 端，因此會終止聚合反應(yīng)的進行。如果分別用4種雙脫氧核苷酸終止反應(yīng)，則會獲 得4組長度不同的DNA片段。通過比較所有DNA片段的長度可以得知核苷酸的 序列。 2． 答： 鹽離子濃度不對，溫度不對，甘油濃度過高。 3． 答： 回文序列是：539。CATATG3， 4． 答： GATATC；AAATTT，因為它們是回文序列。5．答： 注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一 種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星活性?；蚴褂猛ㄓ镁彌_液。 6． 答： 由于反轉(zhuǎn)錄酶缺少在E．coli DNA聚合酶中起校正作用的339。539。外切核酸酶活性，所以聚合反應(yīng)往往會出錯，在高濃度的dNTP和Mg2+下，每500個堿基中可能有一個錯配。 7． 答： 所謂測序酶即是修飾了的T7 DNA聚合酶，是采用缺失的方法，從外切核酸酶結(jié)構(gòu)域中除去28個氨基酸，這樣使T7 DNA聚合酶完全失去了339。539。的外切核酸酶活性，只有539。339。聚合酶的活性，而且聚合能力提高了3～9倍，測序時常用此酶。8． 答： S1核酸酶作圖是一種對RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端和剪接位點進行作圖的方法。9. 答： YAC帶有天然染色體所有的功能元件，包括一個著絲粒，一個DNA復(fù)制起點，兩個端粒。YAC能夠容納長達幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。大片段的插入更有可能包含完整的基因，在染色體步移中每次允許更大的步移距離，同時能夠減少完整基因組文庫所需的克隆數(shù)目。10．答： (1)獨立復(fù)制； (2)有選擇標記； (3)有獨特的酶切位點； (4)能轉(zhuǎn)化但不擴散。11．答： 含有細菌質(zhì)粒和克隆的真核生物DNA片段的雜種質(zhì)粒，有兩個復(fù)制起點和既能在細菌又能在真核細胞中進行選擇的選擇標記，所以，很容易從一宿主轉(zhuǎn)到另一個宿主(來回穿梭)。12. 答： (1)削減分子量(除去非必需區(qū)和整合區(qū))； (2)削減酶切位點； (3)添加選擇標記； (4)引入終止突變13．答： (1)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。 (2)至少要預(yù)先知道足夠合成一對引物的靶DNA序列。14．答： 基因組克隆包含所有不在cDNA中出現(xiàn)的內(nèi)含子。15．答： 化學合成一些長為10bp含有EcoRI識別位點的短的DNA片段，然后與待克隆片段兩端連接起來，如果用EcoRI切割這種連接片段，就會產(chǎn)生EcoRI的單鏈末端。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內(nèi)切酶位點中。16．答： (1)COS位點可以自身環(huán)化； (2)可以利用COS位點包裝l噬菌體顆粒； (3)可以感染寄主細胞； (4)利用質(zhì)粒復(fù)制子復(fù)制，不整合、不裂解。17．答： (1)著絲粒； (2)端粒； (3)ARS序列。18．答： (1)含有來自其他生物DNA的酵母人工染色體，叫YAC； (2)主要特性是可以克隆較大的外源片段。19．答： PCR用雙引物，體內(nèi)復(fù)制用單引物。20．答： 應(yīng)注意的問題有：啟動子、密碼子、剪接、分泌。21．答： 為了擴增突變體的thyA基因，先設(shè)計一對引物，其中一個引物的序列與thyA基因的5’端相同，另一個引物同該基因的3’端互補。在引物的5’端加上合適Ⅱ類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，以便于后來的克隆。將染色體DNA同引物混合后，進行PCR擴增。然后進行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴增片段，可以直接測序或克隆到合適的載體再測序。22．答： 如果你的雜交探針是雙鏈的，可能因為在加人雜交混合物之前忘記將探針變性而得到空白的放射自顯影結(jié)果。23．答： (1)DNaseI造成切口； (2)DNA聚合酶III的5’ 174。3’外切核酸酶進行切割； (3)DNA聚合酶Ⅲ的5’174。3’合成酶進行修補； (4)在修補過程中，隨著切口(nick)的移動，將放射性的底物摻人到雙鏈DNA中。24．答： 原因是：HindⅢ的切點在A基因內(nèi)。25．答： Western印跡是將蛋白質(zhì)經(jīng)電泳分離后從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相支持物上，然后用特異性的抗體進行檢測。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Western印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))。26．答： 基因型是lac．原因是在該密碼子中插入了兩個堿基，造成了移碼突變，所以Lac的基因是缺陷的。27．答： 這是因為細菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng)，并且不能識別真核生物的啟動子之故。四、問答題：1． 說明限制性內(nèi)切核酸酶的命名原則要點。2． 什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性? 受哪些因素影向?3． 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有哪些?4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5．細菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么應(yīng)用?7．Mn2+、Mg2+對Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影響?Dnase I在基因工程中有什么作用?8．質(zhì)粒如何維持在細胞中的穩(wěn)定？9．由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全，進行 嚴格的監(jiān)控，質(zhì)粒載體的安全性是十分重要的。請問質(zhì)粒載體的安全條件包括哪幾 個方面?10．為什么野生型的l噬菌體DNA不宜作為基因工程載體?11． 什么是藍白斑篩選法?12． 藍白斑篩選法為什么也會有假陽性?1