【正文】 _____________。合成酶的活性；(2)339。合成； 339。外切核酸酶；539。C42．(1)遺傳學(xué)方法； (2)物理篩選法； (3)核酸雜交法； (4)表達(dá)產(chǎn)物分析法43．插入外源片段的種類較多，大小又極為相似的重組體的篩選44．基因組DNA；cDNA45．Klenow酶填補(bǔ)的方法；T4DNA聚合酶46．(1)用M13噬菌體載體合成單鏈DNA探針；(2)從mRNA反轉(zhuǎn)錄合成單鏈cDNA探針；(3)用不對稱PCR合成單鏈DNA探針47．外源基因是否進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄48．兩種不同的細(xì)胞群體能夠表達(dá)不同的基因，即在一個群體中能夠表達(dá)一些基因，而 在另一個細(xì)胞群體中不能表達(dá)這些基因49．Northern印跡50．Southern印跡51．5’174。 (a)Sau3A I (b)E．coRI (c)hind III (d)Sau 3A112．限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性是指：( )(a)在非常規(guī)條件下，識別和切割序列發(fā)生變化的活性。這樣既減少純化步驟，也節(jié)約了開支。外切核酸酶切除42．在DNA的酶切反應(yīng)系統(tǒng)中，通常：( ) (a)用SSC緩沖液 (b)加入Mg2+作輔助因子 (c)加入BSA等保護(hù)劑 (d)上述說法中，有兩項(xiàng)是正確的43． 黏性末端連接法，不僅操作方便，而且( ) (a)產(chǎn)生新切點(diǎn) (b)易于回收外源片段 (c)載體不易環(huán)化 (d)影響外源基因的表達(dá)44．在下列表型中，( )是基因工程上理想的受體菌表型 (a)r+m+rec* (b)rmrec (C)rmrec+ (d)r+m+rec45．關(guān)于DNA接頭在基因工程中的作用，下列說法中哪一項(xiàng)不正確?( ) (a)給外源DNA添加適當(dāng)?shù)那悬c(diǎn) (b)人工構(gòu)建載體 (c)調(diào)整外源基因的可讀框 (d)增加調(diào)控元件46．cDNA文庫包括該種生物的( ) (a)某些蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 (b)所有蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 (c)所有結(jié)構(gòu)基因 (d)內(nèi)含子和調(diào)控區(qū)47．下列關(guān)于建立cDNA文庫的敘述中，哪一項(xiàng)是錯誤的?( ) (a)從特定組織或細(xì)胞中提取DNA或RNA (b)用反轉(zhuǎn)錄酶合成mRNA的對應(yīng)單鏈DNA (c)以新合成的單鏈DNA為模板合成雙鏈DNA (d)新合成的雙鏈DNA甲基化 48．下列對黏性末端連接法的評價中，哪一項(xiàng)是不正確的? ( ) (a)操作方便 (b)易于回收片段 (c)易于定向重組 (d)載體易于自身環(huán)化，降低重組率49．關(guān)于感受態(tài)細(xì)胞性質(zhì)的描述，下面哪一種說法不正確?( ) (功具有可誘導(dǎo)性 (b)具有可轉(zhuǎn)移性 (c)細(xì)菌生長的任何時期都可以出現(xiàn) (d)不同細(xì)菌出現(xiàn)感受態(tài)的比例是不同的50．下面關(guān)于用T4多核苷酸激酶標(biāo)記539。OH的存在51．Southem印跡的DNA探針( )雜交。末端標(biāo)記，可用( ) (a)Klenow酶 (b)DNA聚合酶I (c)T4DNA聚合酶 (d)T7DNA聚合酶答案1．c；2．c； 3．b； 4．b 5．b，C，d，e； 6．c； 7．b； 8．d；9．d； 10．B； 11．d； 12．a(chǎn)； 13．d； 14．b 15．d； 16．c；17．a(chǎn)，b；18．a(chǎn)；19．c；20．d；21．c；22．C； 23．b； 24．C；25．d；26．a(chǎn)，C，d；27．b；28．c； 29．b；30．a(chǎn)；31．c； 32．a(chǎn),c,d,e， 33．a(chǎn)，b，c；34．b； 35．c；36．c； 37．d； 38．b；39．c；40．a(chǎn)；41．c； 42．a(chǎn)，b，c； 43．b； 44．b； 45．d； 46．a(chǎn)；47．a(chǎn)； 48．c； 49．c；50．b；51．c； 52．c； 53．b； 54．a(chǎn),c,d；55．a(chǎn)； 56．b；57．a(chǎn)，b； 58．c；59．a(chǎn)；60．d；61．b； 62．c；三、簡答題1．說明Sanger DNA測序法的原理。 11． 什么叫穿梭載體？ 12． 如何將野生型的l噬菌體改造成為一個理想的載體?13． PCR的基本原理是什么?用PCR擴(kuò)增某一基因，必須預(yù)先得到什么樣的信息?14． cDNA克隆與基因組克隆有何不同?15． 怎樣將一個平末端DNA片段插入到EcoR I限制位點(diǎn)中去?16． 簡述以黏粒為載體構(gòu)建基因文庫的原理。根據(jù)方案，下面一步驟 是用NaOH溶液浸泡凝膠，使DNA變性為單鏈。25．什么是Western印跡?它與Southern印跡有什么不同?26．用一限制性內(nèi)切核酸酶切割Lac+ Tet+的質(zhì)粒載體，已知該酶識別的是4個堿基序列， 并產(chǎn)生有兩個堿基突出的單鏈末端，該酶在lac基因內(nèi)有切割位點(diǎn)，并在第二個氨基 酸密碼子內(nèi)，該位點(diǎn)可以被任何氨基酸所取代而不影響酶活性。端聚合(DNA聚合酶參與了細(xì)菌修復(fù)DNA合成過程)；(2)可延 伸的引物必須能提供游離的339。通過比較所有DNA片段的長度可以得知核苷酸的 序列。5．答： 注意星活性，先低鹽，后高鹽；先低溫酶，后高溫酶；并且可以直接在換酶前將第一 種酶失活，再加第二種酶，否則，易產(chǎn)生星活性。外切核酸酶活性，所以聚合反應(yīng)往往會出錯，在高濃度的dNTP和Mg2+下，每500個堿基中可能有一個錯配。339。YAC能夠容納長達(dá)幾百kb的外源DNA，這是質(zhì)粒和黏粒辦不到的。12. 答： (1)削減分子量(除去非必需區(qū)和整合區(qū))； (2)削減酶切位點(diǎn)； (3)添加選擇標(biāo)記； (4)引入終止突變13．答： (1)DNA半保留復(fù)制的原理，在體外進(jìn)行DNA的變性、復(fù)性和引物延伸。這種片段就可以插入到任何EcoRI的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)中。19．答： PCR用雙引物，體內(nèi)復(fù)制用單引物。將染色體DNA同引物混合后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。3’外切核酸酶進(jìn)行切割； (3)DNA聚合酶Ⅲ的5’174。它與Southern的不同在于探針的性質(zhì)不同，在Western印跡中使用的探針是抗體(蛋白質(zhì))。2． 什么是限制性內(nèi)切核酸酶的星號活性? 受哪些因素影向?3． 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有哪些?4． 什么是Klenow酶?有哪些活性?在基因工程中有什么作用?5．細(xì)菌堿性磷酸酯酶和小牛腸堿性磷酸酯酶有什么不同?在基因工程中有什么用途?6．λ外切核酸酶(1ambda exonuclease)基本活性是什么?在基因工程中有什么應(yīng)用?7．Mn2+、Mg2+對Dnase I(deoxyribonuclease ?)的活性有什么影響?Dnase I在基因工程中有什么作用?8．質(zhì)粒如何維持在細(xì)胞中的穩(wěn)定？9．由于基因工程是人為改變遺傳信息的操作，因此必須注意被操作基因的安全，進(jìn)行 嚴(yán)格的監(jiān)控，質(zhì)粒載體的安全性是十分重要的。27． 放射性抗體檢測法(radioactive antibody test)的基本原理是什么?28． 什么是隨機(jī)引物(random primer)?如何標(biāo)記DNA?29．什么是印跡(blotting)雜交?30．什么是原位菌落雜交(colony hybridization)?31．說明Southern雜交的原理和方法。 順序號： 若在同一菌株中分離了幾種限制酶，則按先后順序冠以I、Ⅱ、Ⅲ、… 等，用正體。3． 答： 影響DNA連接酶催化連接反應(yīng)的因素有很多，但溫度對連接反應(yīng)的影響較大。溫度高了難以進(jìn)行末端退火，低于上述溫度會降低連接酶的活性。 另外反應(yīng)體系中有NH4+離子的存在，對E．coli DNA連接酶具有激活作用。聚合酶和339。外切核酸酶活性。外切核酸酶的活性，所以在基因工程中更有用。如在反應(yīng)系統(tǒng)中加入放射性同位素標(biāo)記的脫氧核苷酸，用這種末端填補(bǔ)的方法可以制備339。突出末端則是用Klenow酶的339。突出末端是不理想的，改用T4DNA聚合酶或其他的酶是更好的選擇。的外切核酸酶活性除去339。)作用與聚合(539。不過這一反應(yīng)用T4DNA聚合酶的效果更好，因它的339。5．答： 主要差別是：CIP68176。端脫磷酸，防止DNA的自身連接。單核苷酸，作用底物是雙鏈DNA的539。不能切割帶切口或缺口的dsDNA。7．答： DNase I是一種內(nèi)切核酸酶，在Mg2+存在下，DNase I隨機(jī)切割DNA兩條鏈中的任意一條鏈；當(dāng)Mn2+代替Mg2+時，DNase I幾乎是在雙鏈DNA兩條鏈相對的位置上打開缺口，使雙鏈DNA斷裂，產(chǎn)生的末端幾乎是平末端或只突出1～2個核苷酸的DNA片段。多聚體的形成可能是由于在復(fù)制終止時發(fā)生錯誤或者是由于單體間重組的結(jié)果。 所謂par功能是指某些質(zhì)粒，包括F、R1等質(zhì)粒上具有的一些短的區(qū)域，這些區(qū)域能夠增強(qiáng)質(zhì)?？截惖暮线m分配。par位點(diǎn)是質(zhì)粒同質(zhì)膜結(jié)合的區(qū)域，在細(xì)胞分裂時，由于膜的生長，質(zhì)粒的兩個拷貝就被拉到兩個子細(xì)胞中。當(dāng)細(xì)胞生長時，位點(diǎn)也加倍，每一個質(zhì)?？截惤Y(jié)合一個位點(diǎn)。 將模型A稍微改動一下，就可以滿足質(zhì)粒分離所需的位點(diǎn)。 模型B同模型A基本類似，在這個模型中，質(zhì)粒的兩個拷貝在同質(zhì)膜結(jié)合之前必須通過它們的par位點(diǎn)相互配對?？赡苁窃鰪?qiáng)了質(zhì)粒分離后的迅速復(fù)制，防止了下次分裂時的丟失。這些質(zhì)粒編碼一些毒性蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)一旦表達(dá)就會殺死細(xì)胞。為什么毒性蛋白僅僅是在細(xì)胞丟失了質(zhì)粒之后立即殺死細(xì)胞?當(dāng)細(xì)胞含有這種質(zhì)粒時，沉溺系統(tǒng)的蛋白質(zhì)或RNA可作為一種解毒藥，既能阻止毒蛋白的合成，又能同毒蛋白結(jié)合并阻止毒蛋白起作用。這些系統(tǒng)使細(xì)胞對質(zhì)粒產(chǎn)生溺愛，并防止細(xì)胞丟失質(zhì)粒。(3)一般情況下不希望與宿主染色體發(fā)生重組，因?yàn)橹亟M后有可能給宿主帶來突變。 (3)沒有可供選擇的標(biāo)記。外源基因插人lac(或lac基因部分被取代)后，重組的噬菌體將喪失分解Xgal的能力，轉(zhuǎn)入lac宿主菌后，在含有5—溴—4—氯—3—引哚—b—D—半乳糖苷 (Xgal)平板上形成白色的噬菌斑，非重組的噬菌體則為藍(lán)色噬菌斑。這種插入物的長度可達(dá)幾百個堿基對。 (3)單鏈DNA和雙鏈DNA都可以轉(zhuǎn)染宿主，并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。 (2)具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記。 (5)簡化了篩選。另外由于不同大小的插入片段對宿主細(xì)胞的作用不同，會造成文庫擴(kuò)增量的比例失調(diào)。 輔助噬菌體必需具備如下條件： (1)助噬菌體的DNA IG區(qū)必需失去功能，其本身的DNA不會被包裝到成熟的噬菌體顆粒中； （2）由于輔助噬菌體的IG區(qū)失活，其本身的基因不能表達(dá)，要使輔助噬菌體的所有功能基因都能進(jìn)行表達(dá)，必須在輔助噬菌體的基因組中導(dǎo)人新的復(fù)制起點(diǎn)； (3)輔助噬菌體的基因組中具有選擇標(biāo)記，便于識別和收集一定數(shù)量的輔助噬菌體。一個基因文庫一旦建立，任一特定的克隆都可被回收用于研究其所攜帶的基因，因而在需要克隆某一特定基因時就避免了逐個巡查克隆的耗時過程。基因庫(gene pool)是指在進(jìn)行有性生殖的某一群體中，能進(jìn)行生殖的個體所含總的遺傳信息。選用適合的載體，將合成的cDNA重組導(dǎo)人寄主細(xì)胞，經(jīng)篩選得到韻cDNA克隆群稱為cDNA文庫。cDNA文庫與基因組文庫的主要差別是： (1)基因組文庫克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文庫克隆的是具有蛋白質(zhì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)基因，包括調(diào)節(jié)基因； (2)基因組文庫克隆的是全部遺傳信息，不受時空影響；cDNA文庫克隆的是不完全的編碼DNA序列，因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響； (3)基因組文庫中的編碼基因是真實(shí)基因，含有內(nèi)含子和外顯子；而eDNA克隆的是不含內(nèi)含子的基因。OH上。 同聚物加尾法實(shí)際上是一種人工黏性末端連接法，具有很多優(yōu)點(diǎn)：．(1)首先不易自身環(huán)化，這是因?yàn)橥环NDNA的兩端的尾巴是相同的，所以不存在自身環(huán)化。由于添加了許多同聚物的尾巴，可能會影響外源基因的表達(dá)。23．答： 同裂酶是一類識別序列不完全相同，但是產(chǎn)生的黏性末端至少有四個堿基相同的限制性內(nèi)切核酸酶。由于連接體系中有原有的限制性內(nèi)切核酸酶的存在，就不會發(fā)生載體自連，從而保證了載體同外源DNA的連接。這對了解蛋白質(zhì)的功能區(qū)是十分重要的，可以避免有關(guān)多肽翻譯后加工的一些問題。26．答： 原理： 由于四環(huán)素的作用只是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，而不是殺死細(xì)菌；而氨基酸類似物環(huán)絲氨酸如果摻人蛋白質(zhì)，則是致命的。27．答： 這一方法的基本原理是根據(jù)抗體、抗原分子的三個基本特性而設(shè)計的一種篩選鑒定重組體的方法。29．答： 通過一定的物理學(xué)方法將DNA或RNA從凝膠上轉(zhuǎn)移到固體支持物，然后同液體中的探針進(jìn)行雜交。31．答： 1975年Southern建立起來的一種雜交方法，屬固相—液相雜交。 (2)雖然RNA電泳前不需像DNA那樣進(jìn)行酶切，但也需要變性。一個常用方法是雜交(圖A21．1)： (1)從不同的克隆提取DNA，固定于硝酸纖維素濾膜上，然后用NaOH使之變性(圖 A21．)。 (4)烘干濾膜后進(jìn)行放射自顯影后，所需的克隆就以一個黑點(diǎn)在膠片上顯示出來，這就是菌落或原位雜交分析。一位朋友建議用圖22．7所示的寡聚核苷酸“片段”來進(jìn)行連接。 BamH I切割載體DNA 5’GATCG——————————————————————G3‘ 3’C——————————————————————CCTAG5‘ Kpn I 切割的片斷 5’C——————GGTAC3’ 3’C