第4章基因工程的主要技術(shù)及其原理(編輯修改稿)
2025-03-08 14:17 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 第二節(jié) 凝膠電泳 DNA的等電點(diǎn)偏酸，當(dāng)處于電泳條件（ pH=8）時(shí)， DNA鏈上帶有負(fù)電荷，在電場(chǎng)力的作用下會(huì)向正極泳動(dòng)，由于 DNA鏈上負(fù)電荷的增加伴隨著DNA分子質(zhì)量的增加而增加。所以，實(shí)際上 DNA分子的荷質(zhì)比始終是一常數(shù)，電泳中分離 DNA靠的是分子的大小與構(gòu)型的不同。 一 瓊脂糖凝膠電泳 （一）瓊脂糖凝膠 瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖為支持介質(zhì)，在適當(dāng)條件下對(duì)帶電生物大分子進(jìn)行分離。 瓊脂糖是從瓊脂中提純出來(lái)的，是 D半乳糖和脫水 3,6L半乳糖連接而成的一種線性 分子，具有親水性，不帶電，不引起 DNA變性，不吸附分離物質(zhì)的特點(diǎn)。 凝膠的分辨能力與凝膠的類型和濃度有關(guān)。 不同類型瓊脂糖分離 DNA片段大小范圍 （二）凝膠電泳的影響因素 DNA的分子大小。 線狀雙鏈 DNA分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與 DNA分子量對(duì)數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。 DNA的分子構(gòu)型。 相同分子量的線狀、開(kāi)環(huán)和超螺旋 DNA在瓊脂糖凝膠中移動(dòng)速度是不一樣的 , 超螺旋 DNA移動(dòng)最快 ,而開(kāi)環(huán) DNA分子移動(dòng)最慢 。 凝膠濃度。 一 個(gè)給定大小的線狀 DNA分子 ,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA電泳遷移率的對(duì)數(shù)與凝膠濃度成線性關(guān)系。凝膠濃度的選擇取決于 DNA分子的大小。 電場(chǎng)強(qiáng)度。 電壓一般不超過(guò) 5v/cm ，電壓高，電泳快，但分辨率低。電壓低，電泳慢，但分辨率高。 溴化乙錠。 熒光染料溴化乙啶用于檢測(cè)瓊脂糖凝膠中的 DNA,染料會(huì)嵌入到堆積的堿基對(duì)之間并拉長(zhǎng)線狀和帶缺口的環(huán)狀 DNA，使其剛性更強(qiáng) ,還會(huì)使線狀 DNA遷移率降低 15％。 電泳緩沖液。 電泳緩沖液的組成及其離子強(qiáng)度影響 DNA的電泳遷移率。在沒(méi)有離子存在時(shí) (如誤用蒸餾水配制凝膠 ),電導(dǎo)率最小 , DNA幾乎不移動(dòng) , 在高離子強(qiáng)度的緩沖液中 (如誤加10電泳緩沖液 ), 則電導(dǎo)很高并明顯產(chǎn)熱 , 嚴(yán)重時(shí)會(huì)引起凝膠熔化或 DNA變性 。 二 瓊脂糖變性膠電泳 RNA為單鏈分子，鏈內(nèi)堿基容易配對(duì)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。不同的 RNA分子空間結(jié)構(gòu)不同，在未變性條件下，其相對(duì)分子量與電泳一定距離沒(méi)有嚴(yán)格的相關(guān)性。 常用的 RNA變性膠有兩種： 其一為含有乙二醛 二甲基亞砜（ DMSO）的凝膠； 其二為含甲醛的凝膠。 水平電泳 √ 三 聚丙烯酰胺凝膠電泳 垂直電泳 聚丙烯酰胺凝膠，既具有分子篩效應(yīng)，又具有靜電效應(yīng)，分辨率高于瓊脂糖凝膠，可達(dá)一個(gè)核苷酸。同時(shí)又可用于蛋白質(zhì)的分離。 聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，需要自由基催化完成。 常用的催化方法有化學(xué)聚合和光聚合： 化學(xué)聚合需加入催化劑過(guò)硫酸銨 (AP）和加速劑四甲基乙二胺（ TEMED)。 光聚合是核黃素在光照射下及有微量氧存在時(shí)產(chǎn)生自由基使凝膠聚合。 聚丙烯酰胺凝膠制備在玻璃板上或玻璃管中。 電泳漕分上漕和下漕，各裝有電極，通過(guò)凝膠使它們連成導(dǎo)電的整體。 電泳中帶有電荷的分子在電場(chǎng)作用下移動(dòng)，移動(dòng)速度依賴于電場(chǎng)強(qiáng)度、分子凈電荷以及分子的大小和形狀，同時(shí)也與介質(zhì)的離子強(qiáng)度、黏度和溫度有關(guān)。 四 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳中，在一定的分子量范圍內(nèi) DNA片段泳動(dòng)速率與分子量大小呈線性關(guān)系，但當(dāng) DNA分子大小超過(guò)凝膠孔徑， DNA分子將由無(wú)規(guī)則卷曲的構(gòu)象沿電場(chǎng)方向伸直，變成與電場(chǎng)平行以通過(guò)凝膠空隙，這樣大分子通過(guò)凝膠的速率無(wú)差別，因此無(wú)法區(qū)分。 脈沖電場(chǎng)電泳是一種交替變換電場(chǎng)方向的電泳，以一定的角度并以一定的時(shí)間變換電場(chǎng)的方向，使 DNA在微觀上按“ Z”形向前泳動(dòng)，從而區(qū)分不同大小的 DNA分子。 脈沖場(chǎng)電泳可區(qū)分 50kb或 100kb以上的大片段 DNA分子。 五 凝膠電泳中 DNA的檢測(cè) 凝膠中 DNA的檢測(cè)方法主要有三種： 1. EB染色，然后在紫外燈下觀察，主要用于瓊脂糖凝膠； 2. 銀染顯色法，用于聚丙烯酰胺凝膠電泳； 3. 放射性同位素標(biāo)記發(fā)， 用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。 第三節(jié) 核酸和蛋白質(zhì)的分子雜交 核酸分子雜交原理： 雙鏈 DNA或具有二級(jí)結(jié)構(gòu)的 RNA變性后，其具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈的退火或復(fù)性過(guò)程。 形成的分子有 DNA/DNA,DNA/RNA雜合分子形式。 一 探針的標(biāo)記 探針： 是指用于檢測(cè)特定基
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